Objednat předplatné Zákony pro lidi PLUS
Porovnání znění
Balíčky poznámek

Předpis nemá balíčky komentářů! Přidejte si svůj balíček.

Přidej k oblíbeným

Vyhláška č. 222/2004 Sb.Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Částka 73/2004
Platnost od 29.04.2004
Účinnost od 01.05.2004
Zrušeno k 01.11.2008 (371/2008 Sb.)
Tisková verze Stáhnout PDF Stáhnout DOCX

přidejte vlastní popisek

222

VYHLÁŠKA

ze dne 14. dubna 2004,

kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Ministerstvo životního prostředí stanoví podle § 8 odst. 5 písm. c) zákona č. 356/2003 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů:


§ 1

Metody pro zkoušení fyzikálně-chemických a výbušných vlastností chemických látek (dále jen "látky") a chemických přípravků (dále jen "přípravky"), které jsou uvedeny v příloze č. 1, se použijí pro stanovení

a) bodu tání/bodu tuhnutí,

b) bodu varu,

c) relativní hustoty,

d) tlaku par,

e) povrchového napětí,

f) rozpustnosti ve vodě,

g) rozdělovacího koeficientu,

h) výbušných vlastností,

i) číselně střední molekulové hmotnosti a distribuce molekulové hmotnosti polymerů,

j) obsahu molekul o nízké hmotnosti v polymerech,

k) chování polymerů při rozpouštění/extrakci ve vodě.

§ 2

Metody pro zkoušení vlastností látek a přípravků nebezpečných pro životní prostředí, které jsou uvedeny v příloze č. 2, se použijí pro stanovení

a) akutní toxicity pro ryby,

b) akutní toxicity pro dafnie,

c) inhibice růstu řas,

d) "snadné" biologické rozložitelnosti pomocí – úbytku rozpuštěného organického uhlíku (DOC), – úbytku DOC modifikovanou screeningovou zkouškou, – uvolňování oxidu uhličitého (CO2) modifikovanou Sturmovou zkouškou, – manometrické respirometrie, – zkoušky v uzavřených lahvičkách, – zkoušky MITI,

e) rozložitelnosti – biologická spotřeba kyslíku,

f) rozložitelnosti – chemická spotřeba kyslíku,

g) abiotického rozkladu – hydrolýza jako funkce pH,

h) toxicity pro žížaly – zkouška na umělé půdě,

i) biologické rozložitelnosti – Zahn-Wellensova zkouška,

j) biologické rozložitelnosti – simulační zkouška s aktivovaným kalem,

k) biologické rozložitelnosti – zkouška inhibice dýchání aktivovaného kalu,

l) biologické rozložitelnosti – modifikovaná zkouška SCAS,

m) bioakumulace – průtoková zkouška na rybách,

n) růstu na nedospělých rybách,

o) toxicity na rybích embryích a potěru – krátkodobá zkouška,

p) akutní orální toxicity pro včelu medonosnou,

r) akutní kontaktní toxicity pro včelu medonosnou,

s) adsorpce/desorpce v rovnovážném stavu,

t) odhadu adsorpčního koeficientu (KOU) pro půdy a čistírenské kaly vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC),

u) toxicity pro reprodukci u Daphnia magna,

v) aktivity půdních mikroorganismů při transformaci dusíku,

w) aktivity půdních mikroorganismů při transformaci uhlíku,

x) aerobní a anaerobní transformace v půdě,

y) aerobní a anaerobní transformace v systémech voda-sediment.


§ 3

Zrušuje se:

1. Vyhláška č. 299/1998 Sb., kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí.

2. Vyhláška č. 316/1998 Sb., kterou se stanoví metoda pro zjišťování výbušnosti chemických látek a chemických přípravků.

§ 4

Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem vstupu smlouvy o přistoupení České republiky k Evropské unii v platnost.


Ministr:

RNDr. Ambrozek v. r.


Příloha č. 1 k vyhlášce č. 222/2004 Sb.

METODY PRO ZKOUŠENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH A VÝBUŠNÝCH VLASTNOSTÍ

I. METODY PRO STANOVENÍ BODU TÁNÍ / BODU TUHNUTÍ - metody uvedené v bodu A.1 přílohy směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“)

I.1 METODA

Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).

I.1.1 ÚVOD

Popsané metody a přístroje jsou určeny ke stanovení bodu tání látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.

Výběr metody závisí na povaze látky, která má být zkoumána. Omezením bude tedy skutečnost, zda lze danou látku rozmělnit na prášek snadno, obtížně nebo zda ji nelze rozmělnit.

U některých látek je vhodnější stanovení bodu tuhnutí nebo krystalizace a normalizované metody pro tato stanovení jsou v této metodě rovněž uvedeny.

Nelze-li vzhledem ke. zvláštním vlastnostem látky dobře stanovit žádný z uvedených parametrů, může být vhodné stanovit bod tekutosti.

I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Bod tání je definován jako teplota, při níž dochází za atmosférického tlaku k přechodu z tuhého do kapalného skupenství a která za ideálních podmínek odpovídá bodu tuhnutí.

Vzhledem k tomu, že u mnoha látek dochází k fázovému přechodu v rozmezí teplot, je toto rozmezí často nazýváno rozmezím bodu tání.

Přepočet jednotek (K na °C):

t = T − 273,15

t - Celsiova teplota, stupně Celsia (°C)

T - termodynamická teplota, kelvin (K)

I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Některé kalibrační látky jsou uvedeny v literatuře (4).

I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD

Stanovuje se teplota (teplotní rozmezí) fázového přechodu z tuhého do kapalného skupenství nebo z kapalného do tuhého skupenství. V praxi se při zahřívání/ochlazování vzorku zkušební látky za atmosférického tlaku stanoví teploty počátku tání/tuhnutí a konce tání/tuhnutí. Je popsáno pět typů metod, jmenovitě kapilární metoda, metody používající zahřívací bloky, stanovení bodu tuhnutí, metody termické analýzy a stanovení bodu tekutosti (vyvinuto pro minerální oleje).

V některých případech může být vhodné měřit bod tuhnutí místo bodu tání.

I.1.4.1 Kapilární metoda

I.1.4.1.1 Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní

Malé množství jemně rozmělněné látky se vpraví do kapiláry a zhutní se. Kapilára se zahřívá spolu s teploměrem, přičemž se rychlost nárůstu teploty během tání nastaví na méně než 1 K·min-1. Stanoví se teploty počátku a konce tání.

I.1.4.1.2 Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem

Provádí se podobně jako v bodě 1.4.1.1 s tím rozdílem, že kapilára á teploměr jsou umístěny v kovovém vyhřívaném bloku a pozorují se otvory v bloku.

I.1.4.1.3 Detekce fotočlánkem

Vzorek v kapiláře se automaticky zahřívá v kovovém válci. Otvorem ve válci prochází látkou světelný paprsek na přesně kalibrovaný fotočlánek. Při tání mění většina látek optické vlastnosti a z neprůhledných se mění na průhledné. V tomto okamžiku vzroste intenzita světla dopadajícího na fotočlánek a do zařízení odečítajícího teplotu platinového odporového teploměru umístěného v topné komůrce je vyslán signál k zastavení zaznamenávání. Tato metoda není vhodná pro některé silně zbarvené látky.

I.1.4.2 Zahřívací bloky

I.1.4.2.1 Koflerův zahřívací stolek

Koflerův zahřívací stolek je tvořen dvěma kovovými částmi s různou teplotní vodivostí, je vyhříván elektricky a je konstruován tak, že teplotní gradient je po jeho délce téměř lineární. Teplota stolku se může měnit od 283 do 573 K; stolek je vybaven speciálním zařízením pro odečítání teploty, tvořeným jezdcem s ukazatelem a stupnicí navrženou pro daný stolek. Pro stanovení bodu tání se látka nanese v tenké vrstvě přímo na povrch stolku. Během několika sekund se vytvoří ostrá dělicí linie mezi kapalnou a tuhou fází. Teplota v místě dělicí linie se odečte po nastavení ukazatele na tuto dělicí linii.

I.1.4.2.2 Tavicí mikroskop

Pro stanovení bodu tání velmi malých množství látek se používají různé typy mikroskopů s ohřívacím stolkem. Většina ohřívacích stolků využívá k měření teploty citlivé termočlánky, používají se však i rtuťové teploměry. Typický přístroj pro stanovení bodu tání pomocí mikroskopu s ohřívacím stolkem má ohřívací komoru s kovovou deskou, na kterou se umístí vzorek na podložním sklíčku. Ve středu kovové desky je otvor, kterým může procházet světelný paprsek odražený osvětlovacím zrcátkem mikroskopu. Při měřeních se ohřívací komora přikryje skleněnou destičkou, aby se omezila cirkulace vzduchu v místě, kde se nachází vzorek.

Ohřev vzorku se kontroluje regulačním odporem. Pro velmi přesná měření opticky anisotropních látek lze používat polarizované světlo.

I.1.4.2.3 Menisková metoda

Tato metoda se používá především pro polyamidy.

Vizuálně se stanoví teplota, při které se zřetelně posune meniskus silikonového oleje uzavřeného mezi ohřívacím blokem a skleněnou krycí destičkou umístěnou na vzorku zkoušeného polyamidu.

I.1.4.3 Metoda stanovení bodu tuhnutí

Vzorek se vloží do speciální zkumavky, která se umístí do přístroje pro stanovení bodu tuhnutí. Během ochlazování se vzorek nepřetržitě pomalu míchá a ve vhodných intervalech se odečítá teplota. Jakmile je teplota po několik odečtů konstantní (po odpovídající korekci teploměru), je zaznamenána jako bod tuhnutí.

Podchlazení je nutno zabránit udržováním rovnováhy. mezi tuhou a kapalnou fází.

I.1.4.4 Termická analýza

I.1.4.4.1 Diferenční termická analýza (DTA)

Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi danou látkou a referenční látkou, jež jsou podrobeny stejnému řízenému teplotnímu programu. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu teploty.

I.1.4.4.2 Diferenční skenovací kalorimetrie (DSC)

Při této technice se daná látka a referenční látka podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované danou látkou a referenční látkou jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi danou látkou a referenční látkou. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu tepelného toku.

I.1.4.5 Bod tekutosti

Metoda byla vyvinuta pro minerální oleje a je vhodná pro měření olejovitých látek s nízkým bodem tání.

Po počátečním zahřátí se vzorek určitou rychlostí ochlazuje a v intervalech po 3 K se stanovuje jeho tekutost. Nejnižší teplota, při níž je ještě pozorován pohyb látky, se zaznamená jako bod tekutosti.

I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Použitelnost a přesnost různých metod stanovení bodu / rozmezí bodu tání jsou uvedeny v následující tabulce.

TABULKA: POUŽITELNOST METOD

A. Kapilární metody

Metoda měřeníLátky,
které lze
rozmělnit
na prášek
Látky,
které nelze
snadno
rozmělnit
na prášek
Rozsah
teplot
Odhadnutá
přesnost1)
Existující
norma
Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázníanopouze pro několik látek273 až 573 K±0,3 KJIS K 0064
Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokemanopouze pro několik látek293 až > 573 K±0,5 KISO 1218 (E)
Detekce fotočlánkemanopro některé látky
s použitím přídavných zařízení
253 až 573 K±0,5 K

1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky

B. Zahřívací bloky a stanovení bodu tuhnutí

Metoda měřeníLátky,
které lze
rozmělnit
na prášek
Látky,
které nelze
snadno
rozmělnit
na prášek
Rozsah
teplot
Odhadnutá
přesnost1)
Existující
norma
Koflerův zahřívací stolekanone283 až > 573 K±1,0 KANSI/AST
M D
3451-76
Tavicí mikroskopanopouze pro několik látek273 až > 573 K±0,5 KDIN 53736
Menisková metodanepředevším pro polyamidy293 až > 573 K±0,5 KISO 1218 (E)
Metoda stanovení bodu tuhnutíanoano223 až 573 K±0,5 Knapř. BS 4695

1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky

C. Termická analýza

Metoda měřeníLátky,
které lze
rozmělnit
na prášek
Látky,
které nelze
snadno
rozmělnit
na prášek
Rozsah
teplot
Odhadnutá
přesnost1)
Existující
norma
Diferenční termická analýzaanoano173 až
1 273 K
do 600 K
±0,5 K
do 1 273 K
±2,0 K
ASTM
E 537-76
Diferenční skenovací kalorimetrieanoano173 až
1 273 K
do 600 K
±0,5 K
do 1 273 K
±2,0 K
ASTM
E 537-76

1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky

D. Bod tekutosti

Metoda měřeníLátky, které
lze rozmělnit
na prášek
Látky, které
nelze snadno
rozmělnit na
prášek
Rozsah
teplot
Odhadnutá
přesnost1)
Existující
norma
Teplota tekutostipro minerální oleje
a olejovité látky
pro minerální oleje
a olejovité látky
223 až 323 K±3,0 KASTM
D 97-66

1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky

I.1.6 POPIS METOD

Postupy téměř všech těchto zkušebních metod jsou popsány ve vnitrostátních a mezinárodních normách (viz doplněk 1).

I.1.6.1 Kapilární metody

Při pomalém vzestupu teploty lze u jemně práškovitých látek obvykle rozlišit stupně tání znázorněné na obrázku 1.

Obrázek 1

Obrázek 1

Fáze A (Počátek tání): na vnitřní straně trubičky se stejnoměrně drží jemné kapičky.

Fáze B V důsledku smrštění vzorku se mezi vnitřní stěnou a vzorkem tvoří mezera.

Fáze C Smrštěný vzorek se začíná hroutit dolů a stává se tekutým.

Fáze D Na povrchu se tvoří úplný meniskus, ale značná část vzorku je dosud tuhá.

Fáze E (Konečná fáze tání): Vzorek již neobsahuje žádné tuhé částice.

Během stanovení bodu tání se zaznamenávají teploty počátku tání a konečné fáze.

I.1.6.1.1 Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní

Na obrázku 2 je znázorněna normalizovaná skleněná aparatura pro stanovení bodu tání (JIS K 0064); všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech.

Obrázek 2

Obrázek 2

Kapalinová lázeň:

Je třeba zvolit vhodnou kapalinu. Volba kapaliny závisí na bodu tání, který má být stanovena např. kapalný parafin pro stanovení bodu tání nižšího než 473 K, silikonový olej pro stanovení bodu tání nižšího než 573 K.

Pro stanovení bodu tání vyššího než 523 K lze použít směs tří hmotnostních dílů kyseliny sírové a dvou hmotnostních dílů síranu draselného. S tímto typem směsi je třeba pracovat s náležitou opatrností.

Teploměr:

Měly by se používat pouze teploměry, které splňují požadavky norem ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001 nebo rovnocenných norem.

Postup:

Suchá látka se jemně rozetře v třecí misce a vpraví se do kapiláry zatavené na jednom konci, a to tak, aby po zhutnění byla kapilára naplněna do výšky přibližně 3 mm. Má-li se dosáhnout stejnoměrného zhutnění, nechá se kapilára dopadnout z výšky přibližně 700 mm skleněnou trubicí na hodinové sklíčko.

Naplněná kapilára se vloží do lázně tak, aby se střední část rtuťové baňky teploměru dotýkala kapiláry v místě, kde se nachází vzorek. Kapilára se obvykle vkládá do lázně při teplotě asi o 10 K nižší, než je bod tání.

Lázeň se zahřívá tak, aby vzestup teploty činil přibližně 3 K·min-1. Lázeň se míchá. Asi 10 K pod očekávaným bodem tání se růst teploty upraví na nejvýše 1 K·min-1.

Výpočet:

Bod tání se vypočte takto:

T = TD + 0,00016 (TD − TE) n

kde:

T= korigovaný bod tání v K

TD = odečet teploty na teploměru D v K

TE= odečet teploty na teploměru E v K

n= počet stupňů, o něž rtuťový sloupec teploměru D vyčnívá z kapaliny.

I.1.6.1.2 Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem

Přístroj:

Je tvořen

válcovým kovovým blokem, jehož horní část je dutá a tvoří komoru (viz obrázek 3),

 kovovou krycí deskou se dvěma nebo více otvory, kterými je možno do kovového bloku zavést trubičky,

 ohřívacím systémem kovového bloku, například elektrickým topným odporem uzavřeným v kovovém bloku,

 regulačním odporem pro regulaci příkonu, je-li použit elektrický ohřev,

 čtyřmi okénky ze žáruvzdorného skla v bočních stěnách ohřívací komory, orientovanými vůči sobě pod pravým úhlem. Před jedním z těchto okének je umístěn okulár pro pozorování kapilární trubičky. Ostatní tři okénka slouží k osvětlení vnitřního prostoru žárovkami,

 kapilární trubičkou ze žáruvzdorného skla zatavenou na jednom konci (viz 1.6.1.1).

Teploměr:

Viz normy uvedené v 1.6.1.1 Je rovněž možné použít termoelektrické měřicí přístroje srovnatelné přesnosti.

Obrázek 3

Obrázek 3

I.1.6.1.3 Detekce fotočlánkem

Přístroj a postup:

Přístroj sestává z kovové komory s automatickým ohřívacím zařízením. Tři kapilární trubičky se naplní podle bodu 1.6.1.1 a umístí se do ohřívací komory.

Pro kalibraci přístroje je k dispozici několik lineárních režimů růstu teploty, přičemž vhodný lineární růst teploty se elektricky nastaví předem zvolenou konstantou. Zaznamenávací zařízení ukazují teplotu v ohřívací komoře a teplotu látky v kapilárách.

I.1.6.2 Zahřívací bloky

I.1.6.2.1 Koflerův zahřívací stolek

Viz doplněk.

I.1.6.2.2 Tavicí mikroskop

Viz doplněk.

I.1.6.2.3 Menisková metoda (pro polyamidy)

Viz doplněk.

V oblasti bodu tání by měla být rychlost ohřevu menší než 1 K·min-1.

I.1.6.3 Metody stanovení bodu tuhnutí

Viz doplněk.

I.1.6.4 Termická analýza

I.1.6.4.1 Diferenční termická analýza

Viz doplněk.

I.1.6.4.2 Diferenční skenovací kalorimetrie

Viz doplněk.

I.1.6.5 Stanovení bodu tekutosti

Viz doplněk.

I.2 DATA

V některých případech je nutno provést korekci teploměru.

I.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

použitá metoda,

přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,

 odhad přesnosti.

Jako bod tání se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulky).

Leží-li rozdíl teplot počáteční a konečné fáze tání v mezích přesnosti metody, uvede se jako bod tání konečná teplota, v opačném případě se uvedou obě teploty.

Jestliže se látka před dosažením bodu tání rozkládá nebo sublimuje, uvede se teplota, při které dochází k pozorovanému jevu.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

I.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, (eds.). Experimental thermodynamics. Butterworths, London, 1975, II, 803-834.

(3) R. Weissberger (ed.): Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry. 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, I, Part I, Chapter VII.

(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry. 1976, 48, 505-515.


DODATEK

Další technické podrobnosti je možné zjistit například v následujících normách:

1. Kapilární metody

1.1 Přístroje pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní

ASTM E 32-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals
BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products

1.2 Přístroje pro stanovení bodu tání s kovovým blokem

DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of „melting point“

2. Zahřívací bloky

2.1 Koflerův zahřívací stolek

ANSI/ASTMD 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings

2.2 Tavicí mikroskop

DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunssttoffen

2.3 Menisková metoda (polyamidy)

ISO 1218(E) Plastics - polyamides - determination of „melting point“
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specificatin for acetal resin injection moulding and extrusion materials
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du „point de fusion“. Méthode du ménisque

3. Metody stanovení bodu tuhnutí

BS 4633 Method for the determination of crystallizing point
BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (Cooling Curve)
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la temperature de figeage
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines
NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)
ISO 1392 Method for the determination of the freezing point

4. Termická analýza

4.1 Diferenční termická analýza

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

4.2 Diferenční skenovací kalorimetrie

ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe

5. Stanovení bodu tekutosti

NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils
ISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour point

II. METODY PRO STANOVENÍ BODU VARU - metody uvedené v bodu A.2 přílohy směrnice 92/69/EHS

II.1 METODA

Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECDpro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).

II.1.1 ÚVOD

Popsané metody a zařízení lze použít pro kapaliny a látky s nízkým bodem tání, pokud nepodléhají chemickým reakcím pod bodem varu (např. autooxidaci, přesmyku, rozkladu atd.). Metody lze použít jak pro čisté kapalné látky, tak pro kapalné látky obsahující nečistoty.

Přednost mají metody využívající detekci fotočlánkem a metody termické analýzy, protože umožňují stanovení jak bodu tání, tak bodu varu. Tato měření mohou být navíc prováděna automaticky.

„Dynamická metoda“ má tu výhodu, že ji lze použít i ke stanovení tlaku par a přitom není třeba korigovat bod varu na normální tlak (101,325 kPa), neboť ten lze během měření nastavit manostatem.

Poznámky:

Vliv nečistot na stanovení bodu varu závisí ve velké míře na jejich povaze. Jestliže vzorek obsahuje těkavé nečistoty, které mohou ovlivnit výsledky, může být látky přečištěna.

II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Standardní bod varu je definován jako teplota, při které je tlak par dané kapaliny roven 101,325 kPa.

Jestliže se měření bodu varu neprovádí za normálního tlaku, lze závislost tlaku par na teplotě popsat Clausiovou-Clapeyronovou rovnicí:

ΔHV
log p = ——— + konst.
2,3 RT

kde

p = tlak par látky v Pa

ΔHV = výparné teplo v J·mol-1

R = univerzální molární plynová konstanta = 8,314 J·mol-1·K-1

T= termodynamická teplota v K

Bod varu se uvádí s ohledem na okolní tlak při měření.

Přepočty:

Tlak (jednotka: kPa)

100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa

(jednotka „bar“ je nadále přípustná, její používání se však nedoporučuje)

133 Pa = 1 mm Hg = 1 torr

(jednotky „mm Hg“ a „torr“ nejsou povoleny)

1 atm = standardní atmosféra = 101 325 Pa

(jednotka „atm“ není povolena).

Teplota (jednotka: K)

t = T − 273,15

t - Celsiova teplota, stupeň Celsia (°C)

T - termodynamická teplota, kelvin (K)

II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Některé kalibrační látky jsou uvedeny v doplňku.

II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD

Pět metod stanovení bodu varu (teplotního rozmezí bodu varu) je založeno přímo na měření teploty varu, další dvě využívají termální analýzy.

II.1.4.1 Stanovení ebuliometrem

Ebuliometry byly původně vyvinuty pro stanovení molekulové hmotnosti na základě zvýšení teploty varu, jsou však vhodné také pro přesná měření bodu varu. Velmi jednoduchý přístroj je popsán v normě ASTM D 1120-72 (viz doplněk). V tomto přístroji se kapalina zahřívá za rovnovážných podmínek při atmosférickém tlaku, dokud nezačne vřít.

II.1.4.2 Dynamická metoda

Metoda zahrnuje měření teploty kondenzace páry vhodným teploměrem umístěným za varu ve zpětném toku (refluxu). U této metody lze měnit tlak.

II.1.4.3 Destilační metoda pro stanovení bodu varu

Metoda zahrnuje destilaci kapaliny a měření teploty kondenzace páry, přičemž se stanovuje také množství destilátu.

II.1.4.4 Postup podle Siwoloboffa

Vzorek se zahřívá ve zkumavce, která je ponořena do tepelné lázně. Do zkumavky se vzorkem je zasunuta zatavená kapilára, v jejíž spodní části se nachází vzduchová bublinka.

II.1.4.5 Detekce fotočlánkem

Při použití principu unikajících bublinek podle Siwoloboffa se provádí automatické fotoelektrické měření.

II. 1.4.6 Diferenční termická analýza

Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi danou látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty, přičemž látka a referenční materiál se podrobí témuž řízenému teplotnímu programu. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu teploty.

II.1.4.7 Diferenční skenovací kalorimetrie

Při této technice se látka a referenční materiál podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi látkou a referenčním materiálem. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu tepelného toku.

II.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Použitelnost a přesnost různých metod používaných pro stanovení bodu / teplotního rozmezí bodu varu jsou uvedeny v následující tabulce 1.

TABULKA 1: SROVNÁNÍ METOD

Metoda měřeníOdhadnutá přesnostExistující norma
Stanovení ebuliometrem±1,4 K (do 373 K)1)2)
±2,5 K (do 600 K)1)2)
ASTM D 1120-721)
Dynamická metoda±0,5 K (do 600 K)2)
Destilační metoda (stanovení rozm varu)±0,5 K (do 600 K)ISO/R 918, DIN 53171,
BS 4591/71
Postup podle Siwoloboffa±2 K (do 600 K)2)
Detekce fotočlánkem±0,3 K (při 373 K)2)
Diferenční termická analýza±0,5 K (do 600 K)
±2,0 K (do 1 273 K)
ASTM E 537-76
Diferenční skenovací kalorimetrie±0,5 K (do 600 K)
±2,0 K (do 1 273 K)
ASTM E 537-76

1) Tato přesnost platí pouze pro jednoduchý přístroj, popsaný např. v normě ASTM D 1120-72; může být zlepšena užitím dokonalejšího ebuliometru.

2) Platí pouze pro čisté látky. Užití za jiných okolností by mělo být zdůvodněno.

II.1.6 POPIS METOD

Postupy některých zkušebních metod jsou popsány v mezinárodních a vnitrostátních normách (viz doplněk).

II.1.6.1 Ebuliometr

Viz doplněk.

II.1.6.2 Dynamická metoda

Viz metoda A.4 pro stanovení tlaku par.

Zaznamená se teplota varu naměřená při tlaku 101,325 kPa.

II.1.6.3 Destilační metoda (stanovení rozmezí bodu varu)

Viz doplněk.

II.1.6.4 Postup podle Siwoloboffa

Vzorek se zahřívá ve zkumavce o průměru přibližně 5 mm v přístroji pro stanovení bodu tání (obrázek 1).

Na obrázku 1 je znázorněn normalizovaný přístroj pro stanovení bodu varu (JIS K 0064) (přístroj je skleněný, všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech).

Obrázek 1

Obrázek 1

Do zkumavky se vloží kapilára (varná kapilára) zatavená asi 1 cm nad spodním koncem. Zatavená část kapiláry musí ležet pod hladinou kapaliny. Zkumavka obsahující kapiláru se upevní buď pryžovou páskou k teploměru nebo pomocí bočního držáku (viz obrázek 2).

Obrázek 2

Princip podle Siwoloboffa

Obrázek 2

Obrázek 3

Modifikovaný princip

Obrázek 3

Kapalina pro lázeň se volí podle bodu varu. Pro teploty do 573 K lze použít silikonový olej. Parafinový olej lze použít pouze do 473 K. Kapalina v lázni se zahřívá tak, aby vzestup teploty byl zpočátku asi 3 K·min-1. Lázeň se míchá. Asi 10 K před očekávaným bodem tání se zahřívání sníží tak, aby nárůst teploty byl nejvýše 1 K·min-1. Krátce před dosažením bodu varu začnou z varné kapiláry rychle unikat bublinky.

Bodu varu je dosaženo, když při Ochlazování náhle ustane unikání bublinek a kapalina začne v kapiláře stoupat. Příslušný údaj na teploměru je bodem varu látky.

Modifikovanou metodou (obrázek 3) se bod varu stanovuje v kapiláře pro stanovení bodu tání. Ta se vytáhne do tenké špičky dlouhé asi 2 cm (a) a do ní se nasaje malé množství vzorku. Otevřený konec tenké části kapiláry se zataví tak, aby na konci byla malá vzduchová bublinka. Při zahřívání v aparatuře pro stanovení bodu tání (b) se vzduchová bublinka rozpíná. Bod varu odpovídá teplotě, při které sloupeček látky dosáhne hladiny kapalinové lázně (c).

II.1.6.5 Detekce fotočlánkem

Vzorek se zahřívá v kapiláře ve vyhřívaném kovovém bloku.

Otvory v bloku se vede světelný paprsek tak, aby procházel látkou na přesně kalibrovaný fotočlánek.

Při zvyšování teploty vzorku stoupají z kapiláry jednotlivé vzduchové bublinky. Při dosažení bodu varu počet bublinek značně vzroste. To vede ke změně intenzity světla zaznamenané fotočlánkem a vyvolá signál v měřicím přístroji, kterým se zastaví zaznamenávání teploty měřené platinovým odporovým teploměrem umístěným v bloku.

Tato metoda je zvláště vhodná, protože umožňuje stanovení teplot nižších než laboratorní teplota až do 253,15 K (-20 °C) bez jakékoli úpravy přístroje. Pouze je třeba umístit přístroj v chladicí lázni.

II.1.6.6 Termická analýza

II.1.6.6.1 Diferenční termická analýza

Viz doplněk.

II.1.6.6.2 Diferenční skenovací kalorimetrie

Viz doplněk.

II.2 DATA

Při malých odchylkách od normálního tlaku (nejvýše ±5 kPa) se hodnoty teploty varu přepočítávají na normalizovanou teplotu Tn pomocí Sidneyovy-Youngovy rovnice:

Tn = T + (fT × Δp)

kde:

Δp = (101,325 − p) [pozor na znaménko]

p = naměřený tlak v kPa

fT = velikost změny teploty varu v závislosti na změně tlaku v K·kPa-1

T = naměřená teploty varu v K

Tn= teplota varu korigovaná na normální tlak v K

Teplotní korekční faktory fT a rovnice pro jejich aproximaci jsou uvedeny pro řadu látek ve zmíněných mezinárodních a vnitrostátních normách.

Například metoda podle DIN 53171 uvádí přibližné korekce pro rozpouštědla obsažená v nátěrových hmotách:

TABULKA 2: TEPLOTNÍ KOREKČNÍ FAKTORY fT

Teplota T(K)Korekční faktor fT (K kPa-1)
323,150,26
348,150,28
373,150,31
398,150,33
423,150,35
448,150,37
473,150,39
498,150,41
523,150,44
548,150,45
573,150,47

II.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

použitá metoda,

přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,

odhad přesnosti.

Jako bod varu se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulka 1).

Uvedou se naměřené teploty varu a jejich střední hodnota a dále hodnota tlaku v kPa, při kterém byla měření provedena. Tlak by se měl pokud možno blížit normálnímu tlaku.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

II.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.

(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, (eds.). Experimental thermodynamics. Butterworths, London 1975, volume II.

(3) R. Weissberger (ed.): Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry. 3rd ed. Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.


DODATEK

Další technické podrobnosti je možné zjistit například v následujících normách:

1. Ebuliometr

ASTM D 1120-72Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

2. Destilační postupy (teplotní rozmezí bodu varu)

ISO/R 918Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
BS 4349/68Method for determination of distillation of petroleum products
BS 4591/71Method for the determination of distillation characteristics
DIN 53171Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
NF T 20-608Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation

3. Diferenční termická analýza a diferenční skenovací kalorimetrie

ASTM E 537-76Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
ASTM E 473-85Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005Thermische Analyse: Begriffe

III. METODY PRO STANOVENÍ RELATIVNÍ HUSTOTY - metody uvedené v bodu A.3 přílohy směrnice 92/69/EHS

III.1. METODA

Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Základní principy jsou uvedeny v literatuře (2).

III.1.1 ÚVOD

Popsané metody stanovení relativní hustoty jsou použitelné pro tuhé a kapalné látky bez jakýchkoli omezení, pokud jde o jejich čistotu. Jednotlivé metody, které lze použít, jsou uvedeny v tabulce 1.

III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Relativní hustota D420 tuhých látek nebo kapalin je poměr mezi hmotností určitého objemu zkoumané látky stanovenou při 20 °C a hmotností stejného objemu vody stanovenou při 4 °C. Relativní hustota nemá rozměr.

Hustota látky ρ je podíl hmotnosti látky m a jejího objemu V.

Jednotkou hustoty ρ v soustavě SI je kg·m-3.

III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY (1, 3)

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

III.1.4 PODSTATA METOD

Používají se čtyři skupiny metod.

III.1.4.1 Vztlakové metody

III.1.4.1.1 Hustoměry (pro kapaliny).

Dostatečně přesné a rychlé stanovení hustoty lze provést plovoucími hustoměry, které umožní stanovit hustotu kapaliny odečtením hloubky jejich ponoření na kalibrované stupnici.

III.1.4.1.2 Hydrostatické váhy (pro kapaliny a tuhé látky)

Ke stanovení hustoty zkušebního vzorku lze využít rozdíl mezi jeho hmotností stanovenou na vzduchu a ve vhodné kapalině (např. vodě).

U tuhých látek je naměřená hustota reprezentativní jen pro daný použitý vzorek. Při stanovení hustoty kapalin se zváží těleso známého objemu nejdříve na vzduchu a poté v kapalině.

III.1.4.1.3 Metoda ponořené kuličky (pro kapaliny) (4)

Touto metodou se stanoví hustota kapaliny z rozdílu mezi výsledky vážení kapaliny před ponořením kuličky známého objemu do zkušební kapaliny a po něm.

III.1.4.2 Pyknometrické metody

Pro tuhé látky a kapaliny lze použít pyknometry různých tvarů o známém objemu. Hustota se vypočte z rozdílu výsledků vážení plného a prázdného pyknometru a z jeho známého objemu.

III.1.4.3 Vzduchový srovnávací pyknometr (pro tuhé látky)

Hustotu tuhé látky v libovolné formě je možné měřit při pokojové teplotě plynovým srovnávacím pyknometrem. Objem látky se měří ve vzduchu nebo v inertním plynu v kalibrovaném válci nastavitelného objemu. Pro výpočet hustoty se po skončení měření objemu provede vážení.

III.1.4.4 Oscilační densimetr (5, 6, 7)

Hustotu kapaliny lze měřit oscilačním densimetrem. Mechanický oscilátor konstruovaný ve tvaru U-trubice se rozkmitá na rezonanční kmitočet, který závisí na jeho hmotnosti. Po vložení vzorku se rezonanční kmitočet oscilátoru změní. Aparaturu je nutné kalibrovat dvěma kapalinami o známé hustotě. Kapaliny by měly být voleny nejlépe tak, aby pokrývaly rozmezí, ve kterém leží hustota měřeného vzorku.

III.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Použitelnost různých metod pro stanovení relativní hustoty je uvedena v tabulce.

III.1.6 POPIS METOD

Normy uvedené jako příklady, ve kterých je možno vyhledat technické podrobnosti, jsou uvedeny v doplňku.

Zkoušky musí být provedeny při 20 °C a provedou se nejméně dvě měření.

III.2 DATA

Viz normy.

III.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

použitá metoda,

přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění.

Relativní hustota D420 se uvede podle definice v bodě 1.2 společně se skupenstvím měřené látky.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a skupenství látky.

TABULKA: POUŽITELNOST METOD

Metoda měřeníHustotaNejvyšší
možná hodnota
dynamické
viskozity
Existující
norma
pevné látkykapaliny
1.4.1.1 Hustoměrano5 Pa·sISO 387,
ISO 649-2,
NF T 20-050
1.4.1.2 Hydrostatické váhy
a) tuhé látky
b) kapaliny
anoano5 Pa·sISO 1183 (A),
ISO 901 a 758
1.4.1.3 Metoda ponořené kuličkyano20 Pa·sDIN 53217
1.4.2 Pyknometr
a) tuhé látky
b) kapaliny
anoano500 PasISO 3507,
ISO 1183 (B),
NF T 20-053,
ISO 758
1.4.3 Vzduchový srovnávací pyknometranoDIN 55990
Teil 3,
DIN 53243
1.4.4 Oscilační densimetrano5 Pa·s

III.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) R. Weissberger (ed.), Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry. 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959,I, Part 1.

(3) IUPAC. Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry. 1976, 48, 508.

(4) Wagenbreth, H. Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten. Technisches Messen tm, 1979, 11, 427-430.

(5) Leopold, H. Die digitale Messung von Flüssigkeiten. Elektronik, 1970, 19, 297-302.

(6) Baumgarten, D. Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung. Die Pharmazeutische Industrie,1975,37, 717-726.

(7) Riemann, J. Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium. Brauwissenschaft, 1976, 9, 253-255.


DODATEK

Technické podobnosti lze vyhledat například v následujících normách.

1. VZTLAKOVÉ METODY

1.1 Hustoměr

DIN 12790, ISO 387Hydrometer; general instructions
DIN 12791Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use
Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation
Part III: Use and test
ISO 649-2Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose
NF T 20-050Chemical products for industrial use -Determination of density of liquids -Areometric method
DIN 12793Laboratory glassware: range find hydrometers

1.2 Hydrostatické váhy

Pro tuhé látky
ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics including cellular plastics
NF T 20-049Chemical products for industrial use -Determination of the density of solids other than powders and cellular products - Hydrostatic balance method
ASTM-D-792Specific gravity and density of plastics by displacement
DIN 53479Testing of plastics and elastomers; determination of density
Pro kapaliny
ISO 901 ISO 758
DIN 51757Testing of mineral oils and related materials; determination of density
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 a ASTM D 1481-62
ASTM D 1298Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
BS 4714Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method

1.3 Metoda ponořené kuličky

DIN 53217Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method

2. PYKNOMETRICKÉ METODY

2.1 Pro kapaliny

ISO 3507Pycnometers
ISO 758Liquid chemical products; determination of density at 20°C
DIN 12797Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)
DIN 12798Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100·10-6 m2·s-1 at 15 °C)
DIN 12800Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)
DIN 12801Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100·10-6 m2·s-1 at 20 °C, applicable
in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 °C)
DIN 12806Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also to paints, varnishes and bitumen)
DIN 12807Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)
DIN 12808Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol - water mixture)
DIN 12809Pycnometr with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)
DIN 53217Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer
DIN 51757Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density
ASTM D 297Section 15: Rubber Products - Chemical Analysis
ASTM D 2111Method C: Halogenated organic compounds
BS 4699Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)
BS 5903Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary - stoppered pycnometer method
NF T 20-053Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids - Pycnometric method

2.2 Pro tuhé látky:

ISO 1183Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
NF T 20-053Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids - Pycnometric method
DIN 19683Determination of the density of soils

3. VZDUCHOVÉ SROVNÁVACÍ PYKNOMETRY

DIN 55990Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte
DIN 53243Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung

IV. METODY PRO STANOVENÍ TLAKU PAR - metody uvedené v bodu A.4 přílohy směrnice 92/69/EHS

IV.1 METODA

Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).

IV.1.1 ÚVOD

Pro provádění zkoušky je užitečné mít předběžné informace o struktuře, bodu tání a bodu varu zkušební látky.

Neexistuje žádný postup vhodný pro celý rozsah tlaku par. Proto je pro měření tlaku par v rozmezí od < 10-4 Pa do 105 Pa doporučeno několik metod.

Nečistoty mají obvykle na tlak par vliv, a to v rozsahu, který do značné míry závisí na druhu nečistoty.

Jsou-li ve vzorku přítomny těkavé nečistoty, které by mohly ovlivnit výsledek, může být látka přečištěna. Může být vhodné uvést tlak par technického materiálu.

U některých zde popsaných metod se užívají přístroje s kovovými díly. Tato skutečnost by měla být vzata v úvahu při zkoušení korozivních látek.

IV.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Tlak par látky je definován jako tlak nasycené páry nad tuhou nebo kapalnou látkou. Při termodynamické rovnováze je tlak par čisté látky pouze funkcí teploty.

Jednotkou tlaku v soustavě SI je pascal (Pa).

Dále jsou uvedeny některé dříve používané jednotky s odpovídajícími přepočítávacími faktory:

1 torr (= 1 mm Hg) = 1,333·102 Pa

1 fyzikální atmosféra (atm) = 1,013·105 Pa

1 bar = 105 Pa

Jednotkou termodynamické teploty v soustavě SI je kelvin (K).

Univerzální molární plynová konstanta R má hodnotu 8,314 J·mol-1·K-1.

Závislost tlaku par na teplotě je popsána Clausiovou-Clapeyronovou rovnicí:

ΔHv
log p = ——— + konst.
2,3 RT

kde

p = tlak par látky v Pa,

ΔHV= výparné teplo v J·mol-1,

R = univerzální molární plynová konstanta v J·mol-1·K-1,

T= termodynamická teplota v K.

IV.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

IV.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD

Pro stanovení tlaku par je navrženo sedm metod, které lze používat v různých oblastech hodnot tlaku par. Každou z metod se stanovuje tlak par při různých teplotách. V omezeném rozsahu teplot je logaritmus tlaku par čisté látky nepřímo úměrný teplotě.

IV.1.4.1 Dynamická metoda

Při dynamické metodě se měří teplota varu při daném tlaku.

Doporučený rozsah:

103 až 105 Pa,

Tato metoda se rovněž doporučuje pro stanovení bodu varu a je vhodná až do teploty 600 K.

IV.1.4.2 Statická metoda

Statickou metodou se měří tlak par, který se ustaví při termodynamické rovnováze v uzavřeném systému při dané teplotě. Tato metoda je vhodná pro jednosložkové i vícesložkové tuhé látky a kapaliny.

Doporučený rozsah:

10 až 105 Pa

Při potřebné pečlivosti lze tuto metodu použít také pro oblast od 1 do 10 Pa.

IV.1.4.3 Isoteniskop

Tato normalizovaná metoda je rovněž statickou metodou, obecně však není vhodná pro vícesložkové systémy. Bližší informace lze získat v metodě ASTM D-2879-86.

Doporučený rozsah:

100 až 105 Pa.

IV.1.4.4 Efusní metoda: Váhy pro měření tlaku par

Ve vakuu se stanoví množství látky, které opustí měřicí celu za časovou jednotku otvorem známé velikosti tak, že může být zanedbán návrat látky do měřicí cely (např. měřením impulsů generovaných prouděním par na citlivých vahách nebo stanovením ztráty hmotnosti).

Doporučený rozsah:

10-3 až 1 Pa.

IV.1.4.5 Efusní metoda: Měření hmotnostního úbytku nebo měření záchytem parní fáze

Metoda je založena na stanovení hmotnosti pař zkušební látky unikající za jednotku času z Knudsenovy komůrky (4) mikrodýzou za podmínek vysokého vakua. Hmotnost difundujících par může být zjištěna buď stanovením úbytku hmotnosti komůrky, nebo kondenzací par při nízké teplotě a stanovením jejich množství chromatografickou analýzou. Tlak se vypočte za použití Herzovy-Knudsenovy rovnice.

Doporučený rozsah:

10-3 až 1 Pa

IV.1.4.6 Metoda nasycení plynu

Nad látkou se vede proud inertního nosného plynu tak, že se nasytí jejími parami. Množství látky, které se přenese známým množstvím nosného plynu, lze stanovit zachycením ve vhodném lapači nebo průtokovou analytickou technikou. Z něho se vypočte tlak par při dané teplotě.

Doporučený rozsah:

10-4 až 1 Pa.

Při potřebné pečlivosti lze tuto. metodu použít také pro oblast od 1 do 10 Pa.

IV.1.4.7 Rotující tělísko

V zařízení s rotujícím tělískem je měřicím prvkem malá ocelová kulička zavěšená v magnetickém poli, která vysokou rychlostí rotuje. Tlak plynu se odvozuje ze zpomalení ocelové kuličky, které je závislé na tlaku plynu.

Doporučená oblast měření:

10-4 až 0,5 Pa.

IV.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

V následující tabulce je uvedeno srovnání různých metod stanovení tlaku par z hlediska jejich použitelnosti, opakovatelnosti, reprodukovatelnosti, oblasti měření a existujících norem.

KRITÉRIA JAKOSTI

Metoda
měření
LátkyOdhad
opakovatelnosti1)
Odhad
reprodukovatelnosti1)
Doporučená
oblast
Existující
norma
tuhékapalné
1.4.1
Dynamická metoda
s nízkým
bodem
tání
anodo 25 %do 25 %103 Pa až
2 × 103 Pa
1 až 5 %1 až 5 %2 × 103 Pa
až 105 Pa2)
1.4.2
Statická metoda
anoano5 až 10 %5 až 10 %10 Pa až
105 Pa2)
NF T
20-048(5)
1.4.3
Isoteniskop
anoano5 až 10 %5 až 10 %102 Pa až 105 PaASTM-D
2879-86
1.4.4 Efusní metoda - váhy pro měření tlaku paranoano5 až 20 %do 50 %10-3 Pa až
1 Pa
NF T
20-047(6)
1.4.5 Efusní metoda - měření úbytku paranoano10 až 30 %10-3 Pa až
1 Pa
1.4.6 Metoda sycení plynuanoano10 až 30 %do 50 %10-4 Pa až
1 Pa2)
1.4.7 Metoda rotujícího tělískaanoano10 až'20 %10-4 Pa až 0,5 Pa

1) V závislosti na stupni čistoty látky.

2) Metody mohou být při pečlivém provedení použity také pro rozmezí 1 až 10 Pa.

IV.1.6 POPIS METOD

IV.1.6.1 Dynamická metoda

IV.1.6.1.1 Aparatura

Aparatura je obecně tvořena varnou nádobou s nasazeným chladičem ze skla nebo kovu (obrázek 1), zařízením pro měření teploty, zařízením pro regulaci a měření tlaku. Typická měřicí aparatura znázorněná na obrázku je ze žáruvzdorného skla a skládá se z pěti částí:

Velká, částečně dvojitě oplášťovaná trubice sestává ze zábrusového spoje, z chladiče, z chladicí baňky a ze vpusti.

Skleněný válec s Cottrellovou vývěvou je umístěn ve varné část trubice a má zdrsněný vnitřní povrch ze slinutého skla, aby se zabránilo „utajenému“ varu.

Teplota se měří vhodným teplotním čidlem (např. odporovým teploměrem, plášťovým termočlánkem) zasunutým do aparatury až k místu měření (obrázek 1, číslo 5) přes vhodnou spojku (např. s vnějším zábrusem).

Musí být vytvořeno nezbytné spojení k regulátoru tlaku a k měřicímu zařízení. Přes kapiláru je s měřicí aparaturou spojena kulatá baňka, která slouží jako vyrovnávací objem.

Varná nádoba je vyhřívána topnou vložkou např. zavedenou zespoda do skleněné aparatury. Požadovaná intenzita proudu pro ohřev se nastavuje a reguluje prostřednictvím termočlánku.

Potřebný podtlak mezi 102 Pa a přibližně 105 Pa se dosáhne pomocí vývěvy.

K měření a regulaci tlaku vzduchu nebo dusíku (měřicí rozsah přibližně 102 až 105 Pa) a k ventilaci se použije vhodný ventil.

Tlak se měří manometrem.

IV.1.6.1.2 Postup měření

Pro stanovení tlaku par vzorku se měří jeho teplota varu při různých specifikovaných tlacích mezi asi 103 a 105 Pa. Ustálení teploty při konstantním tlaku znamená, že bylo dosaženo teploty varu. Tato metoda není vhodná pro měření látek, které pění.

Látka se umístí do čisté, suché vzorkovnice. Při plnění tuhých látek, které nejsou ve formě prášku, může dojít k problémům, které však lze někdy obejít zahřátím chladicího pláště. Po naplnění se aparatura uzavře přírubou a látka se odplyní. Poté se nastaví nejnižší požadovaný tlak a zapne se ohřev. Současně se teplotní čidlo připojí k zapisovači.

Rovnováhy je dosaženo, je-li při konstantním tlaku zaznamenána konstantní teplota varu. Je třeba věnovat zvláštní pozornost tomu, aby se zabránilo prudkému uvolňování par během varu. Navíc musí dojít k úplné kondenzaci v chladiči. Při stanovování tlaku par u nízkotajících pevných látek je třeba dbát na to, aby nedošlo k ucpání chladiče.

Po zaznamenání naměřeného rovnovážného teplotního bodu se nastaví vyšší tlak. Takto se pokračuje, dokud se nedosáhne tlaku 105 Pa (celkem asi 5 až 10 měření). Pro kontrolu se musí stanovení rovnovážných bodů opakovat při klesajících hodnotách tlaku.

IV.1.6.2 Statické měření

IV.1.6.2.1 Aparatura

Aparatura sestává ze zásobníku vzorku, z ohřívací a chladicí soustavy k regulaci teploty vzorku a měření teploty. Aparatura též zahrnuje zařízení k nastavení a měření tlaku. Základní principy jsou znázorněny na obrázcích 2a a 2b.

Baňka na vzorek (obrázek 2a) je z jedné strany uzavřena vhodným vysokovakuovým ventilem. Z druhé strany je připojena U-trubicé obsahující vhodnou manometrickou kapalinu. Jeden konec U-trubice je napojen k vývěvě, k tlakové lahvi s dusíkem, nebo k odvzdušňovacímu ventilu a k manometru.

Místo U-trubice se dá použít manometr s ukazatelem tlaku (obrázek 2b).

Za účelem regulace teploty vzorku je baňka se vzorkem spolu s ventilem a U-trubicí či tlakoměrem umístěna v lázni s konstantní teplotou udržovanou s přesností ±0,2 K. Teplota se měří na vnější straně baňky se vzorkem nebo v baňce samotné.

K evakuaci aparatury se užije vývěva s protiproudým chlazeným lapačem.

U metody 2a se tlak par látky měří nepřímo za použití indikátoru nuly. Přitom se zohledňuje skutečnost, že se hustota kapaliny při velkých změnách teploty v U-trubici mění.

V závislosti na rozsahu tlaků a v závislosti na chemickém chování zkušební látky jsou jako indikátory nuly pro U-trubici vhodné následující látky: silikonové oleje, ftaláty. Zkušební látka se nesmí znatelně rozpouštět ani nesmí reagovat s kapalinou v U-trubici.

V oblasti normálního tlaku vzduchu do 102 Pa lze v manometru používat rtuť, zatímco silikonové oleje a ftaláty je vhodné používat pro tlak od 10 Pa do 102 Pa. Ohřívatelné membránové kapacitní manometry lze dokonce používat pro tlak nižší než 10-1 Pa. Existují též jiná měřidla tlaku, která lze použít pro tlaky pod 102 Pa.

IV.1.6.2.2 Postup měření

Před měřením se všechny části aparatury znázorněné na obrázku 2 důkladně očistí a vysuší.

V případě metody 2a se U-trubice naplní zvolenou kapalinou, která musí být před použitím odplyněna za zvýšené teploty.

Zkušební látka se vloží do aparatury, která se uzavře a sníží se v ní teplota, aby došlo k odplynění. Teplota musí být dostatečně nízká, aby se zajistilo vysátí vzduchu, aniž by došlo u vícesložkových směsných materiálů ke změně jejich složení, V případě potřeby lze rovnováhy rychleji dosáhnout mícháním.

Vzorek může být podchlazen např. kapalným dusíkem (je nutno zabránit kondenzaci vzduchu nebo kapaliny z vývěvy) nebo směsí ethylalkoholu a suchého ledu. Pro měření nízkých teplot se použije lázeň s teplotou regulovanou připojením k chladicímu systému (ultrakryomatu).

Při otevřeném ventilu nádoby se vzorkem se připojí na několik minut odsávání, aby se odstranil vzduch. Ventil se poté uzavře a teplota vzorku se sníží na nejnižší požadovanou úroveň. Je-li to nutné, musí se odplyňovací postup několikrát opakovat.

Při zahřívání vzorku roste tlak par. To mění rovnováhu kapaliny v U-trubici. Aby se změna kompenzovala, připouští se ventilem dusík nebo vzduch do té doby, dokud není indikátor tlaku opět na nule. Tlak potřebný k ustavení nulové hodnoty může být odečten přesným manometrem při laboratorní teplotě. Tento tlak odpovídá tenzi par látky při dané teplotě měření.

Metoda 2b je podobná, ale tlak par se odečítá přímo.

Závislost tlaku par na teplotě se stanoví ve vhodných krátkých intervalech (celkem přibližně 5 až 10 bodů měření) až do požadovaného maxima. Odečty při nízkých teplotách se musí pro kontrolu opakovat.

Neleží-li hodnoty zjištěné z opakovaných odečtů na křivce zjištěné pro zvyšující se teplotu, může to být způsobeno jednou z těchto příčin:

1. Vzorek stále obsahuje vzduch (např. u vysoce viskózních materiálů) nebo obsahuje látky s nízkým bodem varu, které jsou při zahřátí uvolňovány a které lze odstranit odsátím po předchozím podchlazení.

2. Teplota podchlazení není dostatečně nízká. V tomto případě se použije jako chladicí médium tekutý dusík.

Pokud nastane případ 1 nebo 2, musí se měření opakovat.

3. V látce probíhá ve vyšetřovaném teplotním rozsahu chemická reakce (např. rozklad, polymerace).

IV.1.6.3 Isoteniskop

Úplný popis této metody je uveden v literatuře (7). Princip měřicího zařízení je znázorněn na obrázku 3. Podobně jako statická metoda popsaná v bodě 1.6.2 je isoteniskop vhodný k vyšetřování tuhých látek i kapalin.

V případě kapalin slouží látka samotná jako indikační sloupec v pomocném manometru. Do isoteniskopu se odměří množství kapaliny postačující k naplnění baňky a krátkého ramene manometru. Isoteniskop se připojí k vakuovému systému, evakuuje se a poté se naplní dusíkem. Evakuace a výplach systému se opakuje dvakrát, aby se odstranil veškerý zbytkový kyslík. Naplněný isoteniskop se umístí do horizontální polohy, aby se vzorek rozprostřel v baňce a v U-části manometru do tenké vrstvy. Tlak v systému se sníží na 133 Pa a vzorek se opatrně zahřeje právě k varu (odstranění rozpuštěných plynů). Poté se isoteniskop vrátí do původní polohy tak, aby se vzorek vrátil do baňky a krátkého ramene manometru, takže oba díly jsou zcela naplněny kapalinou. Tlak se udržuje jako při odplyňování; špička baňky se zahřívá malým plamenem, dokud uvolněná pára neexpanduje natolik, že přetlačí část vzorku z horní části baňky a ramene manometru do manometrické části isoteniskopu, přičemž se vytvoří prostor bez dusíku, naplněný výhradně parami.

Isoteniskop se poté vloží do lázně se stálou teplotou a tlak dusíku se upraví tak, aby se rovnal tlaku vzorku. Rovnovážný tlak je udáván manometrickou částí isoteniskopu. V rovnováze se rovná tlak dusíku tenzi par látky.

U tuhých látek se v závislosti na oblasti tlaku a teploty používají manometrické kapaliny uvedené v bodě 1.6.2.1. Odplyněná manometrická kapalina se naplní do rozšířené části dlouhého ramene isoteniskopu. Poté se vyšetřovaná látka naplní do baňky a odplyní se při zvýšené teplotě. Isoteniskop se poté nakloní, aby manometrická kapalina natekla do U-trubice. Měření závislosti tlaku par na teplotě se provede jako v bodě 1.6.2.

IV.1.6.4 Efusní metoda: Váhy pro měření tlaku par

IV.1.6.4.1 Aparatura

V literatuře jsou popsána různá provedení aparatury (1). Aparatura popsaná zde slouží ke znázornění použitého obecného principu (obrázek 4). Na obrázku 4 jsou znázorněny hlavní části aparatury složené z vysokovakuové komory z korozivzdorné oceli nebo ze skla, z vývěvy a měřiče vakua a z vestavěného zařízení pro měření tlaku par pomocí vah.

V aparatuře jsou vestavěny následující díly:

odpařovací pícka s přírubou a otočnou průchodkou. Odpařovací pícku tvoří válcová nádoba vyrobená např. z mědi nebo z chemicky odolné slitiny s dobrou tepelnou vodivostí. Rovněž lze použít skleněnou nádobu opatřenou měděným pláštěm. Pícka má průměr přibližně 3 až 5 cm a je 2 až 5 cm vysoká. Je opatřena jedním až třemi otvory různé velikosti pro průchod par. Pícka je vyhřívána buď podstavenou vyhřívací destičkou nebo topnou spirálou v plášti. Aby nedošlo k rozptylování tepla do základní desky, je spojení vyhřívací destičky se základní realizováno deskou přes materiál s nízkou tepelnou vodivostí (stříbroniklová nebo chromniklová ocel); je-li např. použita pícka s několika průchody, je izolace tvořena stříbroniklovými trubicemi připojenými k rotující ose pícky. Toto uspořádání je výhodné, neboť umožňuje zavedení měděné tyče. Je tím umožněno chlazení z vnějšku chladicí lázní,

je-li měděné víko pícky opatřeno třemi otvory různého průměru, jejichž poloha je posunuta vůči sobě o 90°, pokrývá měření široký rozsah tlaků par (otvory o průměru 0,30 až 4,50 mm). Široké otvory se použijí při nízkých tlacích par a naopak. Otáčením pícky se žádaný otvor nebo mezipoloha nastaví do směru toku páry (v ose se nachází otvor pícky - clona - miska vah) a proud molekul se propustí nebo odkloní otvorem pícky na misku vah. Pro měření teploty látky se na vhodné místo umístí termočlánek nebo odporový teploměr,

nad clonou je miska velmi citlivých mikrovah (viz níže). Miska vah má průměr přibližně 30 mm. Vhodným materiálem je pozlacený hliník,

miska vah je obklopena válcovitým chladicím blokem z mosazi nebo mědi. Otvory v bloku jsou přizpůsobeny typu raménka podle typu vah a otvor ve cloně musí umožnit průchod proudu molekul a současně musí zajišťovat úplné zkapalnění par na misce. Odvod tepla směrem ven je zajištěn např. měděnou tyčí připojenou k chladicímu bloku. Tyč prochází základní deskou a je od ní tepelně izolována např. trubicí z chromniklové oceli. Tyč je ponořena do Dewarovy nádoby s kapalným dusíkem umístěné pod základní deskou a/nebo se zajistí cirkulace kapalného dusíku přímo provrtanou tyčí. Chladicí blok je tak udržován při teplotě -120 °C. Miska vah je chlazena výhradně vyzařováním, které pro vyšetřovanou oblast tlaku postačuje (zahájení chlazení přibližně 1 h před začátkem měření),

váha je umístěna nad chladicím blokem. Vhodné váhy jsou např. vysoce citlivé dvojramenné elektronické mikrováhy nebo vysoce citlivý přístroj s pohyblivou cívkou (viz Pokyny OECD pro zkoušení 104, vydání 12. 5. 1981),

v základní desce jsou také elektrické zásuvky pro připojení termočlánků (nebo odporových teploměrů) a topných spirál,

vakuum se vytváří V nádobě pomocí středněvakuové nebo vysokovakuové pumpy (požadované vakuum přibližně 1 až 2·10-3 Pa, kterého se dosáhne po dvouhodinovém odsávání). Tlak se sleduje vhodným ionizačním manometrem.

IV.1.6.4.2 Postup měření

Nádoba se naplní zkušební látkou a uzavře se víčkem. Clona a chladicí blok jsou vysunuty proti pícce. Aparatura se uzavře a spustí se vývěvy. Před zahájením měření by měl být tlak asi 10-4 Pa. Od 10-2 Pa je třeba začít s chlazením chladicího bloku.

Po dosažení potřebného vakua se zahájí řada kalibračních měření při nejnižší požadované teplotě. Otevře se odpovídající otvor ve víku, proud páry projde clonou umístěnou nad ním a dopadne na ochlazovanou misku vah. Miska vah musí být dostatečně velká, aby zajistila zachycení veškeré páry procházející clonou. Hybnost proudu par působí jako síla proti misce vah a molekuly se srážejí na jejím studeném povrchu.

Hybnost a současná kondenzace vytvářejí signál v zapisovači. Vyhodnocení signálu poskytuje dva druhy informací:

1. V popsaném zařízení je tlak pár určen přímo z působení na misku vah (k tomu není třeba znát molekulovou hmotnost (2)). Při vyhodnocení odečtu musí být vzaty v úvahu geometrické faktory, jako jsou otvor v pícce a úhel molekulárního proudu.

2. Současně může být měřeno množství kondenzátu, z čehož může být vypočtena rychlost vypařování. Tlak par může být také vypočítán z rychlosti vypařování a z molekulové hmotnosti pomocí Hertzovy rovnice (2).

vzorec

kde

G = rychlost vypařování (kg·s-1·m-2),

M = molekulová hmotnost (g·mol-1),

T = termodynamická teplota (K),

R = univerzální molární plynová konstanta (J·mol-1·K-1),

p = tlak páry (Pa).

Poté, co je dosaženo potřebného vakua, začíná série měření při nejnižší možné teplotě.

Pro další měření se teplota zvyšuje v malých intervalech, dokud se nedosáhne její nejvyšší požadované hodnoty. Vzorek se poté znovu ochladí a je možné zaznamenat druhou křivku tlaku par. Jestliže se při druhém opakování nepotvrdí výsledek prvního měření, je možné, že se látka v dané teplotní oblasti měření rozkládá.

IV.1.6.5 Efusní metoda: Měření hmotnostního úbytku

IV.1.6.5.1 Aparatura

Zařízení se skládá z následujících částí:

blok, ve kterém jsou umístěny efusní komůrky, s možností termostatování a evakuace,

vysokovakuová vývěva (např. difusní vývěva nebo turbomolekulární vývěva) a podtlakové měřidlo,

zařízení pro zachycování par se zkapalněným dusíkem nebo suchým ledem.

Elektricky vyhřívaný hliníkový vakuový blok se čtyřmi ocelovými efusními komůrkami je znázorněn jako příklad na obrázku 5. Membrána z korozivzdorné oceli tloušťky asi 0,3 mm s efusním otvorem o průměru 0,2 až 1 mm je připojena k efusní komůrce víčkem opatřeným závitem.

IV.1.6.5.2 Postup měření

Do každé efusní komůrky se umístí referenční a zkušební látka, kovová membrána s otvorem se zajistí šroubovacím víčkem a každá komůrka se zváží s přesností na 0,1 mg. Měřicí komůrka se umístí do termostatovaného bloku, který se poté evakuuje na tlak nižší, než je jedna desetina očekávaného tlaku par. Ve stanovených časových intervalech v rozmezí od 5 do 30 h se do zařízení vpouští vzduch a úbytek hmotnosti efusní komůrky se stanoví opakovaným vážením.

Aby bylo zajištěno, že výsledky nebudou ovlivněny těkavými nečistotami, váží se komůrka opakovaně ve stanovených časových intervalech a tak se kontroluje, zda je rychlost odpařování konstantní nejméně po dva měřicí intervaly.

Tlak par p je dán vztahem:

vzorec

kde

p = tlak par (Pa),

m = hmotnost látky opouštějící komůrku za čas t (kg),

t = čas (s),

A = plocha otvoru (m2),

K = korekční faktor,

R = univerzální plynová konstanta (J·mol-1·K-1),

T= teplota (K),

M= molekulární hmotnost (kg·mol-1).

Korekční faktor K závisí na poměru délky a poloměru kruhového otvoru:

poměr: 0,10,20,61,02,0
K:0,9520,9090,7710,6720,514

Výše uvedená rovnice může být zapsána ve tvaru

vzorec

kde vzorec je efusní konstanta komůrky.

Tato efusní konstanta může být určena s využitím referenčních látek (2, 9) pomocí následující rovnice:

vzorec

kde

p(r) = tlak par referenční látky (Pa)

M(r)= molekulární hmotnost referenční látky (kg·mol-1).

IV.1.6.6. Metoda nasycení plynu

IV.1.6.6.1 Aparatura

Typická aparatura používaná pro tuto zkoušku sestává z řady dále popsaných a na obrázku 6a vyobrazených částí (1).

Inertní plyn:

Nosný plyn nesmí se zkušební látkou chemicky reagovat. Obvykle je vhodný dusík, někdy je však nutné použít jiné plyny (10). Použitý plyn musí být suchý (viz obrázek 6a, číslo 4: čidlo pro měření relativní vlhkosti plynu).

Kontrola průtoku:

Pro kontrolu průtoku plynu je nezbytný vhodný regulační systém pro zajištění konstantního a podle potřeby nastavitelného průtoku plynu syticí kolonou.

Zařízení pro zachycování par:

Jejich výběr závisí na vlastnostech zkoumané látky a na zvolené analytické metodě. Páry by se měly zachycovat kvantitativně a ve formě, která umožní následnou analýzu. Pro některé zkušební látky jsou vhodné lapače obsahující kapaliny jako hexan nebo ethylenglykol. Pro jiné látky lze použít tuhé absorbenty.

Jako alternativní metody zachycení páry a následné analýzy mohou být ke stanovení množství hmoty transportované známým množstvím nosného plynu použity průtokové analytické techniky, jako je chromatografie. Navíc může být měřen úbytek hmotnosti vzorku.

Výměník tepla:

Pro měření při různých teplotách může být nezbytné zabudovat do aparatury výměník tepla.

Syticí kolona:

Zkušební látka se v rozpuštěné formě nanese na vhodný inertní nosič. Nosič s nanesenou látkou se vloží do sytící kolony. Kolona by měla být dimenzována a průtok plynu nastaven tak, aby bylo zaručeno úplné nasycení nosného plynu. Kyticí kolonu je nutno termostatovat. Má-li se měřit při teplotách nad laboratorní teplotou, musí být části aparatury mezi sytící kolonou a zařízeními pro zachycování par rovněž ohřívány, aby se zamezilo kondenzaci zkušební látky.

Za sytič kolony může být umístěna kapilára (obrázek 6b), aby se snížil tok hmoty způsobený difůzí.

IV.1.6.6.2 Postup měření

Příprava sytící kolony:

Roztok zkušební látky ve vysoce těkavém rozpouštědle se přidá k přiměřenému množství nosiče. Mělo by být přidáno dostatečné množství zkušební látky, aby bylo zajištěno nasycení po celou dobu zkoušky. Rozpouštědlo se úplně odpaří na vzduchu nebo v rotačním odpařovači a pečlivě promísený materiál se přidá do sytící kolony. Po zahřátí vzorku se aparaturou vede suchý dusík.

Měření:

Zařízení na zachycování par nebo průtokové detektory se připojí na výstup z kolony a měří se čas. Na počátku a v pravidelných intervalech během měření se kontroluje průtok počítačem bublinek (nebo kontinuálně průtokoměrem).

Na výstupu ze sytící kolony je nutno měřit tlak. To lze provést

a) zapojením manometru mezi kolonu a lapače (tento způsob nemusí být zcela uspokojivý, protože se zvyšuje mrtvý objem a zvětšuje se adsorpční plocha); nebo

b) stanovením tlakových úbytků za použitým zachycovacím zařízením jako funkce objemového průtoku v samostatném experimentu (toto nemusí přinášet uspokojivé výsledky pro lapače s absorpčními kapalinami).

Doba potřebná pro zachycení množství látky nezbytného pro jednotlivé metody analýzy se určí předběžnými pokusy nebo odhadem. Jako alternativa zachycení látky pro další analýzu může být užita průtoková kvantitativní analytická technika (např. chromatografie). Před výpočtem tlaku par při dané teplotě se provedou předběžné pokusy pro stanovení maximální průtokové rychlosti, při které je nosný plyn dokonale nasycen parami látky. Za tímto účelem se zavádí nosný plyn do sytící kolony nízkým objemovým průtokem voleným tak, že dalším snižováním průtokové rychlosti již vypočtená hodnota tlaku par neroste.

Specifická analytická metoda závisí na druhu studované látky (např. plynová chromatografie nebo gravimetrie).

Stanoví se množství látky, které je unášeno známým objemem nosného plynu.

IV.1.6.6.3 Výpočet tlaku par

Tlak par se počítá z hustoty par, W/V, podle rovnice:

W RT
p = x ——
V M

kde

p = tlak par (Pa),

W = hmotnost odpařené zkušební látky (g),

V = objem nasyceného plynu (m3),

R = univerzální molární plynová konstanta (J·mol-1·K-1),

T = termodynamická teplota (K),

M = molární hmotnost (g·mol-1).

Naměřené objemy musí být korigovány v důsledku rozdílů tlaků a teplot mezi průtokoměrem a sytící kolonou vyhřívanou termostatem. Je-li průtokoměr zařazen za lapači, může být nezbytné provést korekce s ohledem na podíl složek odpařených z lapače (1).

IV.1.6.7 Rotující tělísko (8, 11, 13)

IV.1.6.7.1 Aparatura

Metoda rotujícího tělíska může být provedena za použití měřiče viskozity s rotujícím tělískem, znázorněného na obrázku 8. Schematický nákres měřicí soustavy je znázorněn na obrázku 7.

Typické měřicí zařízení má měřicí hlavu s rotujícím, tělískem, umístěnou v termostatovaném prostoru (regulovaném s přesností na 0,1 °C). Nádobka se vzorkem je umístěna do termostatovaného prostoru (regulovaného s přesností na 0,01 °C). Všechny ostatní části zařízení jsou udržovány při vyšší teplotě, aby nedocházelo ke kondenzaci. K zařízení se vakuovými ventily připojí vysokovakuová vývěva.

Měřicí hlava s rotujícím tělískem se skládá z ocelové kuličky (průměr 4 až 5 mm) umístěné v trubici. Kulička je zavěšena a stabilizována v magnetickém poli obvykle s využitím kombinace permanentních magnetů a regulačních cívek.

Kulička je uváděna do rotačního pohybu rotujícími magnetickými poli produkovanými cívkami. Zvedací cívky měřící nízkou, ale trvalou zbytkovou magnetizaci kuličky, umožňují měření rotační rychlosti.

IV.1.6.7.2 Postup měření

Jakmile kulička dosáhne stanovenou rotační rychlost ν(0) (obvykle asi 400 otáček za sekundu), zastaví se další napájení a zahájí se zpomalování vyvolané brzdicím účinkem plynu.

Pokles rotační rychlosti je měřen jako funkce času. Vzhledem k tomu, že brzdění způsobené magnetickým závěsem je zanedbatelné ve srovnání s brzděním způsobeným plynem, je tlak par dán vztahem:

vzorec

kde

obrazek = průměrná rychlost molekul plynu,

r = poloměr kuličky,

ρ = hustota kuličky,

σ = koeficient tečného přenosového impulsu (σ = 1 pro ideálně kulový povrch kuličky),

t = čas,

ν(t) = rotační rychlost po čase t,

ν(0) = počáteční rotační rychlost.

Rovnice může být rovněž napsána ve tvaru:

vzorec

kde tn tn-1 jsou časy potřebné pro stanovený počet rotací N. Časové intervaly tn, tn-1 následují za sebou a tn > tn-1.

Průměrná rychlost molekul plynu obrazek je dána vztahem:

vzorec

kde

T= teplota,

R = univerzální molární plynová konstanta,

M = molární hmotnost.

IV.2 DATA

Stanovení tlaku par kteroukoli z výše popsaných metod by se mělo provést nejméně při dvou teplotách. Aby se ověřil lineární průběh křivky tlaku par v oblasti teplot od 0 °C do 50 °C, doporučuje se měření při třech nebo více teplotách.

IV.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

použitá metoda,

přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,

nejméně dvě hodnoty tlaku par a teploty, pokud možno v oblasti 0 °C až 50 °C,

všechny původní údaje,

křivka závislosti log p na 1/T,

odhadnutá hodnota tlaku par při 20 °C nebo 25 °C.

Zjistí-li se změna stavu (fázový přechod, rozklad), měly by být uvedeny následující skutečnosti:

druh změny,

teplota při atmosférickém tlaku, při které ke změně dochází,

hodnoty tlaku par při 10 °C a 20 °C pod teplotou přechodu a nad teplotou přechodu (s výjimkou přechodů z tuhého do plynného skupenství).

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

IV.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Ambrose, D. V: B. Le Neindre, B. Vodar, (eds.): Experimental Thermodynamics. Butterworths, London, 1975, II.

(3) R. Weissberger (ed.): Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry. 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959,I, Part I.

(4) Knudsen, M. Ann.Phys.Lpz., 1909, 29, 1979; 1911, 34, 593.

(5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa - Static method.

(6) NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.

(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure-temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

(8) G. Messer, P. Röhl, G. Grosse, W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1987, 5 (4), 2440.

(9) Ambrose, D., Lawrenson, I. J., Sprake, C. H. S. J. Chem. Thermodynamics 1975, 7, 1173.

(10) B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, 85, 435.

(11) G. Comsa, J. K. Fremerey, B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, 17 (2), 642.

(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, 20 (4), 1148.

(13) J. K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, 3 (3), 1715.


DODATEK 1

Metoda odhadu

ÚVOD

Vypočtené hodnoty tlaku par lze využít

k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná,

k provedení odhadu nebo ke stanovení mezní hodnoty v případech, kdy nelze z technických důvodů použít experimentální metodu (včetně případů, kdy je tlak par velmi nízký),

jako pomoc při vyhledání případů, kdy je neprovedení experimentálního měření odůvodnitelné, neboť tlak par je při laboratorní teplotě pravděpodobně < 10-5 Pa.

METODA ODHADU

Tlak par kapalin a tuhých látek může být odhadnut pomocí modifikovaného Watsonova korelačního vztahu (a). Požaduje se pouze jeden experimentální údaj, a to teplota varu za normálního tlaku. Metoda je použitelná pro tlaky od 105 do 10-5 Pa.

Podrobná informace o metodě je uvedena v příručce Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).

POSTUP VÝPOČTU

Podle příručky (b) se tlak par vypočte podle vzorce:

vzorec

kde

T = teplota, pro kterou je tlak par vypočítáván

Tb = teplota varu při normálním tlaku

Pvp = tlak par při teplotě T

∆Hvb = výparné teplo

∆Zb = faktor stlačitelnosti (použije se hodnota 0,97)

m = empirický faktor, jehož hodnota závisí na fyzikálním stavu při teplotě, pro níž je prováděn výpočet

Dále

∆Hvb
——— = KF (8,75 + R lnTb)
Tb

kde

KF je empirický součinitel zohledňující polaritu látky. V příručce b) jsou uvedeny hodnoty faktoru KF pro několik typů sloučenin.

Velmi často jsou k dispozici údaje o teplotě varu při sníženém tlaku. V takovém případě se podle příručky (b) vypočte tlak par podle následujícího vztahu:

vzorec

kde

T1 je teplota varu při sníženém tlaku P1.

ZPRÁVA

Je-li použita metoda odhadu, musí zpráva obsahovat úplný postup výpočtu.

LITERATURA

a) K. M. Watson, Ind. Eng. Chem. 1943, 35, 398.

b) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Estimation Methods. McGraw-Hill, 1982.


DODATEK 2

Obrázek 1

Zařízení pro stanovení křivky tlaku par dynamickou metodou

Obrázek 1

Obrázek 2a

Zařízení pro stanovení křivky tlaku par statickou metodou (s manometrickou U-trubicí)

Obrázek 2a

Obrázek 2b

Zařízení pro stanovení křivky tlaku pař statickou metodou (s použitím ukazatele tlaku)

Obrázek 2b

Obrázek 3

Isoteniskop (viz literatura (7))

Obrázek 3

Obrázek 4

Zařízení pro stanovení křivky tlaku par podle metody stanovení tlaku par pomocí vah

Obrázek 4

Obrázek 5

Příklad zařízení pro odpařování za nízkého tlaku při efusní metodě, vybaveného efusní komůrkou o objemu 8 cm3

Obrázek 5

Obrázek 6a

Příklad průtokového systému pro stanovení tlaku par metodou nasycení plynu

Obrázek 6a

Obrázek 6b

Příklad zařízení pro stanovení tlaku par metodou nasycení plynu s kapilárou zařazenou za syticí kolonu

Obrázek 6b

Obrázek 7

Příklad experimentálního uspořádání pro metodu rotujícího tělíska

Obrázek 7

Obrázek 8

Příklad měřicí hlavy s rotujícím tělískem

Obrázek 8

V. METODY PRO STANOVENÍ POVRCHOVÉHO NAPĚTÍ - metody uvedené v bodu A.5 přílohy směrnice 92/69/EHS

V.1 METODA

Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2).

V.1.1 ÚVOD

Popsané metody jsou určeny pro měření povrchového napětí vodných roztoků.

Před provedením těchto zkoušek je vhodné mít k dispozici předběžné informace o rozpustnosti látky ve vodě, o její struktuře, o hydrolýze a o kritické koncentraci pro tvorbu micel.

Níže uvedené metody jsou použitelné pro většinu chemických látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.

Měření povrchového napětí metodou prstencového tenziometru je omezeno na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižší než přibližně 200 mPa·s.

V.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Povrchová volná enthalpie vztažená na jednotku povrchu se nazývá povrchové napětí.

Povrchové napětí se vyjadřuje těchto jednotkách:

N·m-1 (v soustavě SI) nebo

mN·m-1 (odvozená jednotka v soustavě SI)

1 N·m-1 = 103 dyn·cm-1

1 mN·m-1 = 1 dyn·cm-1 ve staré soustavě CGS

V.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Referenční látky, které pokrývají široké rozpětí hodnot povrchového napětí, jsou uvedeny v literatuře (1, 3).

V.1.4 PODSTATA METOD

Metody jsou založeny na měření největší síly, kterou je nutné působit ve svislém směru na třmínek nebo prstenec, který se dotýká povrchu zkoumané kapaliny umístěné v měřicí nádobě, aby se od tohoto povrchu oddělil, nebo na destičku, která se svým okrajem dotýká povrchu, aby se vzniklý film vytáhl nahoru.

Látky, jejichž rozpustnost ve vodě dosahuje hodnoty alespoň 1 mg·l-1 se zkoušejí ve vodných roztocích při jedné koncentraci.

V.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Přesnost těchto metod je pravděpodobně vyšší, než je požadováno pro účely hodnocení stavu životního prostředí.

V.1.6 POPIS METOD

Připraví se roztok látky v destilované vodě. Koncentrace roztoku by měla být 90 % koncentrace nasyceného roztoku látky ve vodě; pokud tato koncentrace přesáhne 1 g·l-1, použije se k měření roztok o koncentraci 1 g·l-1. Látky, jejichž rozpustnost je menší než 1 mg·l-1, není nutné zkoušet.

V.1.6.1 Destičková metoda

Viz ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).

V.1.6.2 Třmínková metoda

Viz ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).

V.1.6.3 Prstencová metoda

Viz ISO 304 a NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liquid films).

V.1.6.4 Harmonizovaná prstencová metoda OECD

V.1.6.4.1 Aparatura

Pro toto měření jsou vhodné komerční tenziometry. Sestávají z těchto částí:

pohyblivý stolek pro vzorek,

systém měření síly,

měřicí tělísko (prstenec),

měřicí nádoba.

V.1.6.4.1.1 Pohyblivý stolek pro vzorek

Pohyblivý stolek pro vzorek slouží jako podložka pro termostatovanou měřicí nádobu, ve které je kapalina, která má být zkoušena. Spolu se systémem měření síly je upevněn na stojanu.

V.1.6.4.1.2 Systém měření síly

Systém měření síly je umístěn nad stolkem pro vzorek (viz obrázek). Chyba měření síly nemá překročit ±10-6 N, což odpovídá chybě ±0,1 mg při měření hmotnosti. Ve většině případů je měřicí stupnice komerčních tenziometrů dělena v mN·m-1, takže je možné povrchové napětí odečítat přímo v mN·m-1 s přesností na 0,1 mN·m-1:

V.1.6.4.1.3 Měřicí tělísko (prstenec)

Prstenec je obvykle zhotoven z platino-iridiového drátu o průměru asi 0,4 mm a středním obvodu 60 mm. Prstenec z drátu je zavěšen vodorovně na upevňovací vidlici z drátu a na kovové tyčince, která tvoří spojení k systému měření síly (viz obrázek).

Obrázek

Měřicí tělísko
(všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech)

Obrázek

V.1.6.4.1.4 Měřicí nádoba

Měřicí nádobou pro zkušební roztok je termostatovaná skleněná nádoba. Má být konstruována tak, aby teplota zkoumané kapaliny i plynné fáze nad jejím povrchem zůstala během měření konstantní a aby se vzorek nemohl odpařovat. Vhodná je válcová skleněná nádoba o vnitřním průměru nejméně 45 mm.

V.1.6.4.2 Příprava aparatury

V.1.6.4.2.1 Čištění

Skleněné nádoby je třeba pečlivě vyčistit: Pokud je to nutné, měly by se vymýt horkou kyselinou chromsírovou a následně koncentrovanou kyselinou fosforečnou (83 až 98% hmot. H3PO4), pečlivě vypláchnout tekoucí vodou a nakonec omýt redestilovanou vodou do neutrální reakce a následně vysušit nebo vypláchnout vzorkem kapaliny, která má být měřena.

Prstenec je třeba nejprve pečlivě umýt vodou, aby se odstranily všechny látky rozpustné ve vodě. Poté se krátce ponoří do kyseliny chromsírové, opláchne se v redestilované vodě do neutrální reakce a nakonec se krátce ohřeje nad methanolovým plamenem.

Poznámka:

Znečištění látkami, které se nerozpouštějí ani nerozkládají kyselinou chromsírovou ani kyselinou fosforečnou, jako například silikony, je nutné odstraňovat vhodnými organickými rozpouštědly.

V.1.6.4.2.2 Kalibrování aparatury

Validace aparatury spočívá v ověření nuly a v nastavení přístroje tak, aby jeho údaje umožňovaly spolehlivé stanovení v mN·m-1.

Poloha:

Přístroj musí být nastaven do vodorovné polohy, např. pomocí libely položené na základovou desku tenziometru a nastavením stavěcích šroubů základnové desky.

Nastavení nuly:

Po upevnění prstence na aparatuře a před ponořením do kapaliny je třeba nastavit nulu ukazatele tenziometru a zkontrolovat rovnoběžnost prstence s hladinou kapaliny. K tomu je možné použít hladiny kapaliny jako zrcadla.

Kalibrace:

Vlastní kalibraci před měřením je možné provést dvěma postupy:

a) Použitím závaží: při tomto postupu se použijí jezdce o známé hmotnosti od 0,1 g do 1,0 g, které se umístí na prstenec. Kalibrační faktor фa, kterým je třeba násobit všechny hodnoty odečtené na přístroji, je možné určit podle rovnice (1):

σr
фa = ——
σa

kde:

m g
σr = —— (mN·m-1)
2b

m = hmotnost jezdce (g),

g = tíhové zrychlení (981 cm·s-2 na úrovni hladiny moře),

b = střední obvod prstence (cm),

σa = odečtená hodnota na tenziometru po umístění jezdců na prstenec (mN·m-1).

b) Použitím vody: při tomto postupu se použije čistá voda, jejíž povrchové napětí má při 23 °C hodnotu 72,3 mN·m-1. Tento postup lze provést rychleji než kalibraci se závažími, ale existuje vždy nebezpečí, že povrchové napětí vody je zkresleno stopovým znečištěním povrchově aktivními látkami.

Kalibrační faktor фb, kterým je třeba násobit všechny hodnoty odečtené na přístroji, je možné určit podle rovnice (2):

σ0
фb = ——
σg

kde:

σ0 = hodnota povrchového napětí vody uvedená v literatuře (mN·m-1),

σg = naměřená hodnota povrchového napětí vody (mN·m-1),

obě při stejné teplotě.

V.1.6.4.3 Příprava vzorků

Připraví se vodné roztoky zkušebních látek o požadované koncentraci, které nesmějí obsahovat nerozpuštěné složky.

Roztoky musí být udržovány při konstantní teplotě (±0,5 °C). Protože se povrchové napětí roztoku v měřicí nádobě v čase mění, provedou se měření v různých časech a sestrojí se křivka závislosti povrchového napětí na čase. Nedochází-li k žádným dalším změnám, bylo dosaženo rovnovážného stavu.

Měření je ovlivňováno znečištěním prachem nebo plynnými látkami. Práce musí být tedy prováděny pod ochranným krytem.

V.1.6.5 Zkušební podmínky

Měření se provádí přibližně při +20 °C a udržuje se tolerance ±0,5 °C.

V.1.6.6 Postup zkoušky

Roztoky, které mají být měřeny, se převedou do pečlivě vyčištěné měřicí nádoby, přičemž je třeba dbát na to, aby nedošlo k pěnění, a nádoba se poté postaví na stolek zkušební aparatury. Horní část stolku s měřicí nádobou se vysune tak vysoko, aby se prstenec ponořil pod povrch roztoku, který má být měřen. Horní část stolku se následně postupně a rovnoměrně sníží (rychlostí přibližně 0,5 cm·min-1), aby došlo k oddělení prstence od povrchu, a to až do dosažení maximální hodnoty síly. Film kapaliny lpící na prstenci se od něho nesmí odtrhnout. Po ukončení měření se prstenec opět ponoří pod povrch a postup se opakuje až do dosažení konstantní hodnoty povrchového napětí. Při každém stanovení se začne zaznamenávat čas v okamžiku plnění roztoku do měřicí nádoby. Odečty se provedou vždy v okamžiku, kdy je dosaženo maximální síly nutné pro oddělení prstence od povrchu kapaliny.

V.2 DATA

Za účelem výpočtu povrchového napětí se hodnota odečtená na přístroji v mN·m-1 nejprve vynásobí kalibračním faktorem фa nebo фb (podle použitého postupu kalibrace). Získá se tak hodnota, která však platí pouze přibližně, a vyžaduje proto korekci.

Harkins a Jordan (4) empiricky stanovili korekční faktory pro hodnoty povrchového napětí měřeného prstencovou metodou, které závisí na rozměrech prstence, hustotě kapaliny a jejím povrchovém napětí.

Vzhledem k tomu, že je zdlouhavé stanovovat pro každé jednotlivé měření korekční faktor z tabulek Harkinse a Jordana, lze pro výpočet povrchového napětí vodných roztoků použít zjednodušenou metodu, která spočívá v odečtu korigovaných hodnot povrchového napětí přímo z tabulky. (Pro odečtené hodnoty, které leží mezi hodnotami uvedenými v tabulce, se provede interpolace.)

TABULKA: KOREKCE NAMĚŘENÝCH HODNOT POVRCHOVÉHO NAPĚTÍ

Pouze pro vodné roztoky, ρ ≅ 1 g·cm-3

R = 9,55 mm (střední poloměr prstence)

r = 0,185 (poloměr drátu prstence)

Experimentální hodnota
(mN·m-1)
Korigovaná hodnota (mN·m-1)
Kalibrace závažími
(viz 1.6.4.2.2 písm. a))
Kalibrace vodou
(viz 1.6.4.2.2 písm. b))
2016,918,1
2218,720,1
2420,622,1
2622,424,1
2824,326,1
3026,228,1
3228,130,1
3429,932,1
3631,834,1
3833,736,1
40.35,638,2
4237,640,3
4439,542,3
4641,444,4
4843,446,5
5045,348,6
5247,350,7
5449,352,8
5651,254,9
5853,257
6055,259,1
6257,261,3
6459,263,4
6661,265,5
6863,267,7
7065,269,9
7267,272
7469,2-
7671,2-
7873,2-

Tabulka byla sestavena na základě korekcí podle Harkinse a Jordana. Je obdobou tabulky podle normy DIN 53914 pro vodu a vodné roztoky (hustota ρ = 1 g·cm-3); platí pro běžný komerční prstenec o rozměrech R = 9,55 mm (střední poloměr prstence) a r = 0,185 mm (poloměr drátu prstence). Tabulka udává korigované hodnoty pro měření povrchového napětí získané po kalibraci závažími nebo vodou.

Jiným řešením je vypočítat povrchové bez předchozí kalibrace podle rovnice:

f × F
σ = ———
4 π·R

kde

F = síla udaná měřicím systémem při oddělení filmu

R = poloměr prstence

f = korekční faktor (1)

V.3 ZPRÁVY

V.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

použitá metoda,

druh vody nebo použitého roztoku,

přesná specifikace látky (identifikace a nečistoty),

výsledky měření: povrchové napětí (odečtené hodnoty) s uvedením jednotlivých odečtených hodnot a jejich aritmetického průměru a rovněž korigované střední hodnoty (přičemž se bere v úvahu kalibrační faktor a tabulka korekcí),

koncentrace roztoku,

zkušební teplota,

stáří použitého roztoku, zejména časový odstup mezi přípravou roztoku a měřením,

znázornění časové závislosti povrchového napětí po převedení roztoku do měřicí nádoby,

uvedou se všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.

V.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Vzhledem k tomu, že povrchové napětí vody je 72,75 mN·m-1 při 20 °C, měly by být látky vykazující za podmínek této metody povrchové napětí menší než 60 mN·m-1 považovány za povrchově aktivní materiály.

V.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) R. Weissberger (ed.). Technique of Organic Chemistry, 3rd ed. Interscience Publ., New York, 1959, 1, Part I, Chapter XIV.

(3) Pure and Applied Chem., 48, 1976, 511.

(4) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc., 52, 1930, 1751.

VI. METODY PRO STANOVENÍ ROZPUSTNOSTI VE VODĚ - metody uvedené v bodu A.6 přílohy směrnice 92/69/EHS

VI.1 METODA

Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

VI.1.1 ÚVOD

Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici předběžné informace o strukturním vzorci látky, o tenzi par, disociační konstantě a o hydrolýze (jako funkci pH).

Neexistuje jediná dostupná metoda pro celý rozsah rozpustností ve vodě.

Dvě níže popsané metody pokrývají celý rozsah rozpustnosti, nejsou však použitelné pro těkavé látky:

první metoda, použitelná pro v podstatě čisté látky s malou rozpustností (< 10-2 g·l-1), stálé ve vodě; tato metoda se označuje jako „sloupcová eluční metoda“,

druhá metoda, použitelná pro v podstatě čisté látky s vyšší rozpustností (> 10-2 g·l-1), stálé ve vodě; tato metoda se označuje jako „banková metoda“.

Rozpustnost zkušební látky ve vodě může být značně ovlivněna přítomností nečistot.

VI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Rozpustnost látky ve vodě je definována hmotnostní koncentrací jejího nasyceného roztoku ve vodě při dané teplotě. Rozpustnost ve vodě se udává v jednotkách hmotnosti na objem roztoku. Jednotkou v soustavě SI je kg·m-3 (může se také používat g·l-1).

VI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při zkoušení nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

VI.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD

Přibližné množství vzorku a doba nutná pro dosažení hmotnostní koncentrace nasyceného roztoku by měly být stanoveny jednoduchou předběžnou zkouškou.

VI.1.4.1 Sloupcová eluční metoda

Tato metoda je založena na vymývání zkušební látky vodou z mikrokolony, naplněné inertním nosičem, např. skleněnými kuličkami nebo pískem, pokrytým přebytkem zkušební látky. Rozpustnost ve vodě se stanoví, jsou-li hmotnostní koncentrace eluátu konstantní. To se projeví jako plató závislosti koncentrace na čase.

VI.1.4.2 Banková metoda

V této metodě se látka (tuhé látky musí být ve formě prášku) rozpustí ve vodě při teplotě, která je o něco vyšší než teplota měření. Po dosažení nasycení se roztok ochladí a udržuje se při teplotě měření, za stálého míchání, dokud se nedosáhne rovnováhy. Jinou možností je provést měření přímo při zkušební teplotě, pokud je vhodným vzorkováním prokázáno, že je dosaženo rovnovážného nasycení. Hmotnostní koncentrace látky ve vodném roztoku, který nesmí obsahovat žádné nerozpuštěné částice, se následně stanoví vhodnou analytickou metodou.

VI.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

VI.1.5.1 Opakovatelnost

Při sloupcové eluční metodě je dosažitelná opakovatelnost < 30 %; při baňkové metodě by mělo být dosaženo opakovatelnosti < 15 %.

VI.1.5.2 Citlivost

Závisí na analytické metodě, lze však stanovit hmotnostní koncentrace až do 10-6 g·l-1.

VI.1.6 POPIS METOD

VI.1.6.1 Zkušební podmínky

Zkouška se provádí pokud možno při teplotě 20 ± 0,5 °C. Předpokládá-li se závislost rozpustnosti ve vodě na teplotě (> 3 % na 1 °C), měla by být provedena měření při dvou dalších teplotách, které jsou nejméně o 10 °C vyšší a nižší než původně zvolená teplota. V tomto případě by měla být teplota udržována v toleranci ±0,1 °C. Zvolenou teplotu je třeba udržovat ve všech důležitých částech aparatury konstantní.

VI.1.6.2 Předběžná zkouška

K přibližně 0,1 g vzorku (tuhé látky musí být v práškové formě) v 10ml odměrném válci uzavíratelném skleněnou zátkou se přidává vzrůstající objem destilované vody o laboratorní teplotě podle kroků uvedených v následující tabulce:.

0,1 g rozpuštěno v „x“ ml vody0,10,51210100> 100
Přibližná rozpustnost (g·l-1)> 1 0001 000 až 200200 až 100100 až 5050 až 1010 až 1< 1

Po každém přidání množství vody uvedeného v tabulce se směsí intenzivně třepe po dobu 10 min a vizuálně se kontroluje obsah nerozpuštěných částic. Zůstane-li vzorek nebo jeho část po přidání 10 ml vody nerozpuštěný, experiment je nutno opakovat ve 100 ml odměrném válci s větším objemem vody. Při nízkých rozpustnostech může být doba potřebná k rozpuštění látky podstatně delší (je vhodné vyčkat alespoň 24 h*). Přibližná rozpustnost je uvedena v tabulce pod objemem vody potřebným k úplnému rozpuštění vzorku. Není-li látka ani poté úplně rozpuštěna, je vhodné vyčkat delší dobu než 24 h (maximálně 96 h), nebo ředit dále, aby se zjistilo, zda by měla být použita sloupcová eluční metoda nebo banková metoda.

VI.1.6.3 Sloupcová eluční metoda

VI.1.6.3.1 Nosič, rozpouštědlo a eluent

Nosič pro sloupcovou eluční metodu by měl být inertní. Vhodnými materiály, které lze použít, jsou skleněné kuličky a písek. K nanesení zkušební látky na nosič by mělo být použito vhodné těkavé analyticky čisté rozpouštědlo. Jako eluent by měla být použita voda redestilovaná ve skleněné nebo křemenné aparatuře.

Poznámka:

Nesmí se použít voda získaná přímo z organického měniče iontů.

VI. 1.6.3.2 Nanášení na nosič

Odváží se přibližně 600 mg nosiče a převede se do 50ml baňky s kulatým dnem.

Přiměřené odvážené množství zkušební látky se rozpustí ve zvoleném rozpouštědle. Dostatečný podíl tohoto roztoku se přidá k nosiči. Rozpouštědlo musí být dokonale odpařeno, např. v rotační odparce, jinak se nedosáhne úplného nasycení nosiče vodou kvůli rozdělovacím efektům na povrchu nosiče.

Nanášení zkušební látky na nosič může být problematické (chybné výsledky), sráží-li se zkušební látka na nosiči jako olej nebo krystalická fáze. Problém by měl být řešen experimentálně a podrobnosti by měly být zaznamenány.

Nosič s nanesenou látkou se nechá 2 h botnat v asi 5 ml vody a suspense se poté naplní do mikrokolony. Je také možné naplnit mikrokolonu, která byla předtím naplněna vodou, suchým nosičem s nanesenou látkou a poté nechat během dvou hodin ustavit rovnováhu.

Zkušební postup:

Vymývání látky z nosiče lze provádět dvěma různými způsoby:

oběhovým čerpadlem (viz obrázek 1),

vyrovnávací nádobou (viz obrázek 4).

VI.1.6.3.3 Vymývání kolony použitím oběhového čerpadla

Aparatura

Schematické uspořádání typického systému je znázorněno na obrázku 1. Vhodná mikrokolona je znázorněna na obrázku 2, přijatelná je ovšem i kterákoli jiná velikost za předpokladu, že budou splněna kritéria opakovatelnosti a citlivosti. Prostor hlavy kolony by měl mít obsah nejméně pěti objemů sloupce a měl by být schopný pojmout nejméně pět vzorků. Prostor hlavy kolony může být menší, pokud se počátečních pět objemů sloupce eluovaných s nečistotami nahradí čistým rozpouštědlem.

Kolona by měla být připojena k oběhovému čerpadlu, které zajišťuje konstantní průtok asi 25 ml·h-1. Čerpadlo se připojí hadičkami z polytetrafluorethylenu (PTFE), a/nebo skleněnými trubičkami. U aparatury složené z kolony a čerpadla musí být možnost odběru eluátu a vyrovnávání tlaku v hlavě kolony s atmosférickým tlakem. Materiál v koloně se fixuje malým (5 mm) smotkem skelné vaty, který současně slouží k odfiltrování částeček. Lze použít např. peristaltické nebo membránové čerpadlo (přitom je třeba dbát na to, aby nedošlo ke znečištění materiálem hadičky a/nebo aby nedošlo k absorpci tímto materiálem).

Postup měření

Zahájí se vymývání kolony. Doporučuje se průtok asi 25 ml·h-1 (to odpovídá u popsané kolony desetinásobku objemu sloupce za hodinu). Nejméně prvních pět objemů sloupce obsahujících nečistoty rozpustné ve vodě se odstraní. Poté se nechá běžet oběhové čerpadlo až do ustavení rovnováhy, které je dosaženo, neliší-li se koncentrace pěti po sobě následujících vzorků při náhodném výběru o více než ±30 %, přičemž rozdíly jsou nepravidelné. Tyto vzorky by se měly odebírat v intervalech, během kterých kolonou projde objem eluentu rovný nejméně desetinásobku objemu sloupce.

VI.1.6.3.4 Vymývám kolony pomocí vyrovnávací nádoby

Aparatura (viz obrázek 3 a 4)

Vyrovnávací nádoba: je připojena zabroušeným spojem, který je spojen hadičkou z PTFE. Doporučuje se použít rychlost průtoku přibližně 25 ml·h-1. Podíly eluátu následující po sobě se shromažďují a jejich koncentrace se analyzují zvolenou metodou.

Postup měření:

Pro stanovení rozpustnosti ve vodě se použijí prostřední podíly eluátu, ve kterých zůstávají koncentrace nejméně v pěti po sobě jdoucích vzorcích konstantní (±30 %).

V obou případech (při použití oběhového čerpadla nebo vyrovnávací nádoby) se druhé promytí provede při poloviční průtokové rychlosti. Shodují-li se výsledky obou pokusů, považuje se výsledek za uspokojivý; je-li zdánlivá rozpustnost při nižší průtokové rychlosti vyšší, je nutné průtok snižovat vždy na polovinu tak dlouho, dokud dva po sobě následující měření neposkytnou stejnou hodnotu rozpustnosti.

V obou případech (v případě oběhového čerpadla nebo vyrovnávací nádoby) je nutné vzorky podrobit zkoušce na koloidní částice pomocí. Tyndallova jevu (rozptylem světla). Přítomností takových částic je výsledek znehodnocen a zkouška by měla být opakována po zlepšení filtrační funkce kolony.

Mělo by být zaznamenáno pH každého vzorku. Druhé měření je třeba provést při stejné teplotě.

VI.1.6.4 Banková metoda

VI.1.6.4.1 Zařízení

Tato metoda vyžaduje následující vybavení:

běžné laboratorní skleněné nádoby a pomůcky,

zařízení pro třepání roztoků při regulovaných konstantních teplotách,

odstředivka (nejlépe termostatovaná), je-li nezbytná v případě emulzí, a

přístroje pro analytická stanovení.

VI.1.6.4.2 Postup měření

Množství materiálu potřebné pro nasycení požadovaného objemu vody se odhadne z předběžného pokusu. Potřebný objem vody závisí na analytické metodě a na rozsahu rozpustnosti. Do tří skleněných nádobek opatřených skleněnými zátkami (např. centrifugačních kyvet, baněk) se naváží asi pětinásobek odhadnutého množství materiálu. Do každé z nádobek se přidá zvolené množství vody a nádobky se těsně uzavřou. Uzavřené nádobky se poté třepou při 30 °C. (K tomuto účelu by měla být použita třepačka nebo míchačka pracující při konstantní teplotě, např. magnetické míchání v termostatované vodní lázni.) Po jednom dnu se jedna z nádobek vyjme a nechá se za občasného míchání 24 h stát, aby se ustálila rovnováha při teplotě měření. Poté se obsah nádobky odstředí při teplotě měření a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace zkušební látky. Po dvou, resp. třech dnech se zbylé dvě nádobky po předchozím ustavení rovnováhy nasycení při 30 °C zpracují podobným způsobem. Odpovídají-li hodnoty koncentrace alespoň u posledních dvou nádobek požadované reprodukovatelnosti, je stanovení uspokojivé. Pokud hodnoty koncentrací pro nádobky 1, 2 a 3 vykazují stoupající tendenci, mělo by být celé stanovení opakováno s prodloužením doby pro ustavení rovnováhy.

Měření může být provedeno i bez předběžné inkubace při 30 °C. S cílem zjistit rychlost ustavení saturační rovnováhy se odebírají vzorky do té doby, dokud doba míchání ovlivňuje koncentraci měřeného roztoku.

Mělo by být zaznamenáno pH každého vzorku.

VI.1.6.5 Analýza

Pro tato stanovení se upřednostňuje analytická metoda specifická pro danou látku, protože malá množství rozpuštěných nečistot mohou způsobit velké chyby při stanovení rozpustnosti ve vodě. Příklady těchto analytických metod jsou plynová nebo kapalinová chromatografie, titrační metody, fotometrické metody, voltametrické metody.

VI.2 DATA

VI.2.1 SLOUPCOVÁ ELUČNÍ METODA

Pro každý pokus by měla být vypočtena střední hodnota z nejméně pěti po sobě následujících vzorků vybraných z oblasti po dosažení rovnovážného nasycení a rovněž by měla být vypočtena směrodatná odchylka. Výsledky by měly být uvedeny v jednotkách hmotnosti na jednotku objemu roztoku.

Porovnají se střední hodnoty dvou zkoušek provedených za různých rychlostí průtoku a jejich opakovatelnost by měla být menší než 30 %.

VI.2.2 BAŇKOVÁ METODA

Výsledky pro každou,ze tří baněk se uvedou samostatně a jsou-li ustálené (opakovatelnost je lepší než 15%), zprůměrují se a vyjádří se v jednotkách hmotnosti na jednotku objemu roztoku. Je-li rozpustnost velmi vysoká (>100g·l-1), může to vyžadovat přepočet hmotnostních jednotek na objemové jednotky s využitím hustoty roztoku.

VI.3 ZPRÁVY

VI.3.1 SLOUPCOVÁ ELUČNÍ METODA

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

výsledky předběžné zkoušky,

přesná specifikace látky (identita a nečistoty),

jednotlivé koncentrace, hodnoty rychlosti průtoku a pH pro každý vzorek,

střední hodnoty a směrodatné odchylky nejméně pro pět vzorků z rovnovážné oblasti křivky nasycení z každého pokusu,

průměrná hodnota dvou po sobě následujících přijatelných měření,

teplota vody během procesu tvorby nasyceného roztoku,

použitá analytická metoda,

druh použitého materiálu nosiče,

způsob nanesení studované látky na nosič,

použité rozpouštědlo,

poznatky o jakékoli chemické nestálosti látky během zkoušky a při použité analytické metodě,

všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.

VI.3.2 BAŇKOVÁ METODA

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

výsledky předběžné zkoušky,

přesná specifikace látky (identita a nečistoty),

výsledky jednotlivých analytických stanovení a průměrné hodnoty, pokud byla pro každou nádobku stanovena více než jedna hodnota,

hodnota pH každého vzorku,

průměrná hodnota pro dvě různé nádobky, jejichž výsledky jsou ve shodě,

teplota při zkoušce,

použitá analytická metoda,

poznatky o jakékoli chemické nestabilitě látky během zkoušky a při použité analytické metodě,

všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.

VI.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final

(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method

(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method


DODATEK

Obrázek 1

Sloupcová eluční metoda s oběhovým čerpadlem

Obrázek 1

Obrázek 2

Typická mikrokolona (všechny rozměry v mm)

Obrázek 2

Obrázek 3

Typická mikrokolona (všechny rozměry v mm)

Obrázek 3

Obrázek 4

Sloupcová eluční metoda s vyrovnávací nádobou

Obrázek 4

VII. METODY PRO STANOVENÍ ROZDĚLOVACÍHO KOEFICIENTU -metody uvedené v bodu A.8 přílohy směrnice 92/69/EHS

VII.1. METODA

Popsaná metoda „třepací lahve“ je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

VII.1.1 ÚVOD

Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici předběžné informace o strukturním vzorci látky, disociační konstantě, rozpustnosti ve vodě, hydrolýze, rozpustnosti v n-oktanolu (oktan-1-olu) a o povrchovém napětí.

U disociujících látek by měla být měření prováděna pouze s nedisociovanou formou (volná kyselina nebo volná báze), získanou při použití vhodného pufru o pH nejméně o 1 nižším (volná kyselina) nebo vyšším (volná báze) než pK.

Tato zkušební metoda zahrnuje dva samostatné postupy: metodu třepací lahve a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC). První metodu lze použít, leží-li hodnota log Po/v (definice viz níže) v rozmezí -2 až 4, a druhou metodu, leží-li hodnota log Po/v v rozmezí 0 až 6. Před provedením kteréhokoli z experimentálních postupů by měl být nejdříve získán předběžný odhad rozdělovacího koeficientu.

Metoda třepací lahve je použitelná pouze pro v podstatě čisté látky, které jsou rozpustné ve vodě a n-oktanolu. Nelze ji použít pro povrchově aktivní látky (pro které by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na příslušných rozpustnostech v n-oktanolu a vodě).

Metoda HPLC není použitelná pro silné kyseliny a zásady, komplexní sloučeniny kovů, povrchově aktivní látky a látky, které reagují s eluentem. Pro tyto látky by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech v n-oktanolu a vodě.

Metoda HPLC je méně citlivá na přítomnost nečistot ve zkušební látce než metoda třepací lahve. Někdy však mohou nečistoty ztížit interpretaci výsledků, protože přiřazení píků se stává nejistým. U směsí, které dávají nerozlišitelný pás, by měly být uvedeny spodní a horní mez hodnoty log P.

VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací (ci) rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly. V případě n-oktanolu a vody platí:

coktan-1-ol
Po/v = ————
cvoda

Rozdělovací koeficient (P) je tedy podílem dvou koncentrací a udává se obvykle ve formě svého dekadického logaritmu (log P).

VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Metoda třepací lahve

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provádění metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Metoda HPLC

Za účelem korelace hodnot naměřených pro danou sloučeninu metodou HPLC s její hodnotou P je nutné sestrojit kalibrační graf závislosti log P na chromatografických datech tvořený nejméně šesti referenčními body. Vhodné referenční látky zvolí uživatel. Pokud je to možné, měla by mít alespoň jedna referenční látka Po/v vyšší než zkušební látka a jiná referenční látka Po/v nižší než zkušební látka. U hodnot log P nižších než 4 může být kalibrace založena na údajích získaných metodou třepací lahve. U hodnot log P vyšších než 4 může být kalibrace založena na ověřených hodnotách z literatury, pokud jsou v souladu s vypočtenými hodnotami. Za účelem dosažení vyšší přesnosti je vhodnější volit látky, které mají podobnou strukturu jako zkušební látka.

Rozsáhlé seznamy hodnot Po/v pro mnoho skupin chemických látek jsou dostupné v literatuře (2, 3). Nejsou-li k dispozici údaje o rozdělovacích koeficientech látek s podobnou strukturou, lze použít obecnější kalibraci s jinými referenčními látkami.

Seznam doporučených referenčních látek a jejich hodnot Po/v je uveden v doplňku 2.

VII.1.4 PODSTATA METOD

VII.1.4.1 Metoda třepací lahve

Pro stanovení rozdělovacího koeficientu musí být dosaženo rovnováhy mezi všemi vzájemně působícími složkami systému a musí být stanoveny koncentrace látek rozpuštěných v obou fázích. Ze studia literatury vztahující se k této otázce vyplývá, že k řešení tohoto problému lze použít několik různých postupů, např. důkladné promíchání obou fází a jejich následné oddělení za účelem stanovení rovnovážných koncentraci vyšetřované látky.

VII.1.4.2 Metoda HPLC

HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupnou pevnou fází obsahující dlouhé uhlovodíkové řetězce (např. C8, C18) chemicky vázané na oxid křemičitý. Chemické látky nastříknuté do této kolony se v ní pohybují různou rychlostí v důsledku různých stupňů rozdělení mezi mobilní fázi a uhlovodíkovou stacionární fázi. Směsi chemikálií se eluují v pořadí své hydrofobnosti, přičemž se látky rozpustné ve vodě eluují jako první a látky rozpustné v olejích jako poslední, úměrně svému rozdělovacímu koeficientu uhlovodíky-voda. To umožňuje určit vztah mezi retenčním časem v této koloně (s reversními fázemi) a rozdělovacím koeficientem n-oktan/voda. Rozdělovací koeficient se odvodí z kapacitního faktoru k, daného výrazem:

tR − to
k = ———
to

v němž tR = retenční čas zkušební látky, to = průměrná doba, kterou molekula rozpouštědla potřebuje k průchodu kolonou (mrtvá doba).

Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení elučních dob.

VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

VII.1.5.1 Opakovatelnost

Metoda třepací lahve

S cílem zaručit správnost hodnoty rozdělovacího koeficientu se provedou opakovaná stanovení při třech různých zkušebních podmínkách, přičemž lze měnit jak množství dané látky, tak poměr objemů obou rozpouštědel. Dekadické logaritmy stanovených hodnot rozdělovacího koeficientu by měly ležet v rozmezí ±0,3.

Metoda HPLC

S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena opakovaná stanovení. Hodnoty log P získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,1.

VII.1.5.2 Citlivost

Metoda třepací lahve

Měřicí rozsah metody je určen mezí detekce analytické metody. Ta by měla umožnit stanovení hodnot log Po/v v oblasti od -2 do 4 (pokud to podmínky dovolí, lze tuto oblast rozšířit až do hodnoty log Po/v rovné 5), není-li koncentrace rozpuštěné látky v žádné z fází vyšší než 0,01 mol·l-1.

Metoda HPLC

Metoda HPLC umožňuje stanovení rozdělovavích koeficientů v rozsahu log Po/v od 0 do 6.

Obvykle je možné určit rozdělovací koeficient dané látky s přesností ±1 řádu vzhledem k hodnotě získané metodou třepací lahve. Typické korelace lze nalézt v literatuře (4, 5, 6, 7, 8). Vyšší přesnosti lze obvykle dosáhnout, je-li korelační závislost založena na referenčních látkách podobné struktury (9).

VII.1.5.3 Specifičnost

Metoda třepací lahve

Nernstův rozdělovací zákon platí pro zředěné roztoky jen při konstantní teplotě a konstantním tlaku a pH. Platí pouze pro čistou látku rozdělenou mezi dvě čistá rozpouštědla. Je-li současně v jedné nebo obou fázích přítomno více rozpuštěných látek, může tím být výsledek ovlivněn.

Disociace nebo asociace rozpuštěných molekul vede k odchylkám od Nernstova rozdělovacího zákona. Tyto odchylky se projevují tím, že se rozdělovací koeficient stává závislým na koncentraci roztoku.

V důsledku existujících mnohonásobných rozdělovacích rovnováh by tato metoda neměla být použita bez korekcí na disociovatelné sloučeniny. Pro tyto sloučeniny by mělo být zváženo použití pufračních roztoků namísto vody; pH pufračního roztoku by se mělo lišit od pKa látky nejméně o 1, přičemž se zohlední význam tohoto pH s ohledem na životní prostředí.

VII.1.6 POPIS METODY

VII.1.6.1 Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu

Hodnotu rozdělovacího koeficientu lze nejlépe odhadnout na základě výpočtu (viz doplněk 1) nebo popřípadě z poměru rozpustností zkušební látky v čistých rozpouštědlech (10).

VII.1.6.2 Metoda třepací lahve

VII.1.6.2.1 Příprava

n-Oktanol: Stanovení rozdělovacího koeficientu by mělo být provedeno s n-oktanolem (oktan-1-olem) čistoty p.a.

Voda: měla by být použita destilovaná voda nebo redestilovaná voda ve skleněné nebo křemenné aparatuře. V případě potřeby by měly být u disociovatelných látek použity místo vody pufrační roztoky.

Poznámka:

Neměla by být použita voda pocházející přímo z měniče iontů.

VII.1.6.2.1.1 Předběžné nasycení rozpouštědel

Před stanovením rozdělovacího koeficientu se fáze rozpouštědlového systému vzájemně nasytí třepáním při teplotě experimentu. K dosažení tohoto cíle je vhodné 24 h třepat na mechanické třepačce ve dvou velkých zásobních lahvích vysoce čistý n-oktanol nebo vysoce čistou vodu, obojí s dostatečným množstvím druhého rozpouštědla, a poté nechat rozpouštědla stát tak dlouho, dokud se obě fáze neoddělí a dokud není dosaženo nasycení.

VII.1.6.2.1.2 Příprava zkoušky

Celkový objem dvoufázového systému by měl téměř naplňovat zkušební nádobu. Tím se zamezí ztrátám látek v důsledku odpařování. Poměry objemů a množství látek, které mají být použity, jsou dány

předběžným odhadem rozdělovacího koeficientu (viz výše),

minimálním množstvím zkušební látky nezbytným pro postup analýzy, a

omezením maximální koncentrace v každé fázi na 0,01 mol·l-1.

Provedou se tři zkoušky. Při první se použije vypočtený poměr objemů n-oktanolu a vody; při druhé se tento poměr dělí dvěma a při třetí se tento poměr násobí dvěma (např. 1 : 1, 1 : 2, 2 : 1).

VII.1.6.2.1.3 Zkušební látka

Připraví se zásobní roztok v n-oktanolu předem nasyceném vodou. Koncentrace tohoto zásobního roztoku by měla být před jeho použitím ke stanovení rozdělovacího koeficientu přesně stanovena. Tento roztok by měl být uchováván za podmínek, které zajistí jeho stálost.

VII.1.6.2.2 Zkušební podmínky

Zkušební teplota by měla být konstantní (±1 °C) a měla by ležet v rozmezí 20 a 25°C.

VII.1.6.2.3 Postup měření

VII.1.6.2.3.1 Ustavení rovnováhy rozdělení

Pro každou ze zkušebních podmínek by měly být připraveny dvě zkušební nádoby obsahující potřebná přesně odměřená množství obou rozpouštědel spolu s nezbytným množstvím zásobního roztoku.

Fáze n-oktanolu je nutné odměřit objemově. Zkušební nádoby by měly být umístěny do vhodné třepačky, nebo by měly být třepány ručně. Při použití centrifugační kyvety spočívá doporučený postup v tom, že se kyveta rychle otáčí kolem své příčné osy o 180°, takže případný zachycený vzduch stoupá vzhůru oběma fázemi. Ze zkušenosti vyplývá, že k ustavení rovnovážného rozdělení obvykle stačí 50 takových otočení. Pro jistotu se doporučuje 100 otočení během pěti minut.

VII.1.6.2.3.2 Oddělení fází

V případě potřeby lze oddělení fází provést odstředěním směsi. Odstředění by mělo být provedeno laboratorní odstředivkou udržovanou při laboratorní teplotě, nebo, je-li použita odstředivka bez regulace teploty, by měly být centrifugační kyvety za účelem ustavení rovnováhy udržovány alespoň jednu hodinu před analýzou při zkušební teplotě.

VII.1.6.2.4 Analýza

Za účelem stanovení rozdělovacího koeficientu je nutné stanovit koncentrace zkušební látky v obou fázích. To lze provést odebráním alikvotního podílu každé z obou fází z každé kyvety a pro každou zkušební podmínku a jejich analýzou zvoleným postupem. Celkové množství látky přítomné v obou fázích by mělo být vypočteno a porovnáno s původně dodaným množstvím látky.

Odběr vzorku z vodné fáze je nutné provést postupem minimalizujícím riziko znečištění stopami n-oktanolu: k odběru vzorků vodné fáze lze použít skleněnou injekční stříkačku s vyměnitelnou jehlou. Stříkačka se nejprve částečně naplní vzduchem. Vzduch se při průchodu jehly vrstvou n-oktanolu opatrně vypudí. Do stříkačky se natáhne dostatečný objem vodné fáze. Stříkačka se z roztoku rychle vytáhne a jehla se sejme. Obsah stříkačky lze poté použít jako vzorek vodné fáze. Koncentrace v obou od sebe oddělených fázích by měla být stanovena nejlépe metodou, která je specifická pro danou látku. Příklady možných vhodných analytických metod jsou

fotometrické metody,

plynová chromatografie,

vysokoúčinná kapalinová chromatografie.

VII.1.6.3 Metoda HPLC

VII.1.6.3.1 Příprava

Aparatura

Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulzním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovacími smyčkami. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může závažně zhoršit účinnost kolony HPLC. Stacionární fáze by proto měla mít minimální podíl polárních skupin (11). Lze použít komerční mikročásticové náplně s reversními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona.

Mobilní fáze

K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol čistoty pro HPLC a voda čistoty pro HPLC, které se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Doporučuje se použít směsi methanol/voda s minimálním obsahem vody 25 %. Obvykle vyhovuje pro eluci sloučenin o log P = 6 během jedné hodiny při průtokové rychlosti 1 ml·min-1 směs methanol / voda 3 : 1 (obj.). U sloučenin s vysokou hodnotou log P může být nutné zkrátit eluční dobu (stejně tak u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.

Látky s velmi nízkou rozpustností v n-oktanolu mají tendenci při použití metody HPLC vykazovat abnormálně nízké hodnoty log Po/v; píky těchto sloučenin někdy doprovázejí čelo rozpouštědla. Je to pravděpodobně způsobeno tím, že proces rozdělení je příliš pomalý, než aby bylo dosaženo rovnováhy za dobu, po kterou obvykle trvá dělení metodou HPLC. Pro dosažení spolehlivé hodnoty může být v takovém případě účinné snížení průtokové rychlosti nebo snížení poměru methanol/voda.

Zkušební i referenční látka by měly být rozpustné v mobilní fázi v dostatečných koncentracích umožňujících jejich detekci. Pouze ve výjimečných případech mohou být u směsi methanol/voda použita aditiva, neboť aditiva mění vlastnosti kolony. V případě chromatogramů získaných při použití aditiv, musí být použita samostatná kolona téhož typu. Nevyhovuje-li směs methanol-voda, lze použít směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol-voda nebo acetonitril-voda.

Pro disociovatelné látky je kritické pH eluentu. Mělo by ležet v pracovní oblasti pH kolony, která je obvykle 2 až 8. Doporučuje se použití pufračních roztoků. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého při pH vyšším než 8 se nedoporučuje, neboť použití alkalické mobilní fáze může způsobit rychlé narušení činnosti kolony.

Rozpouštěné látky

Referenční látky by měly mít nejvyšší dostupnou čistotu. Sloučeniny, které se mají používat pro zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi.

Zkušební podmínky

Teplota by během měření neměla kolísat o více než ±2 K.

VII.1.6.3.2 Měření

Výpočet mrtvé doby t0

Mrtvou dobu t0 je možné stanovit buď pomocí homologické řady (např. n-alkylmethylketonů) nebo nezadržovaných organických sloučenin (např. thiomočoviny nebo formamidu). Pro výpočet mrtvé doby t0 s použitím homologické řady se nastříkne sada alespoň sedmi členů homologické řady a stanoví se příslušné retenční časy. Neupravené retenční časy tr(nc+1)se vynesou jako funkce tr(nc) a stanoví se absolutní člen a a směrnice b regresní rovnice:

tr(nc+1) = a + b tr(nc)

(nc = počet atomů uhlíku). Mrtvá doba t0 je dána vztahem:

t0 = a/(1 − b)

Kalibrační křivka

Následujícím krokem je sestrojení korelační závislosti hodnot log k na log P pro příslušné referenční látky. V praxi se současně nastříkne soubor 5 až 10 standardních referenčních látek, jejichž log P leží v očekávané oblasti, a stanoví se retenční časy, nejlépe zapisovacím integrátorem napojeným na detekční systém. Vypočtou se příslušné logaritmy kapacitních faktorů, log k, a vynesou se jako funkce hodnot log P stanovených metodou třepací lahve. Kalibrace se provádí v pravidelných intervalech nejméně jednou denně, aby bylo možné zohlednit případné změny činnosti kolony.

Stanovení kapacitního faktoru zkušební látky

Zkušební látka se nastříkne v co nejmenším množství mobilní fáze. Stanoví se retenční čas (dvakrát), umožňující výpočet kapacitního faktoru k. Z korelační křivky referenčních látek je možné interpolací získat rozdělovací koeficient zkušební látky. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. V těchto případech je nutno věnovat zvláštní pozornost intervalům spolehlivosti regresní křivky.

VII.2 DATA

Metoda třepací lahve

Spolehlivost stanovených hodnot P je možné prověřit srovnáním středních hodnot z opakovaných stanovení s celkovou střední hodnotou.

VII.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

přesnou specifikaci látky (identitu a nečistoty),

nejsou-li metody použitelné (např. u povrchově aktivní látky), měla by být uvedena vypočtená hodnota nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech látky v n-oktanolu a vodě,

všechny informace a poznámky, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.

Pro metodu třepací lahve:

výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,

teplotu stanovení,

údaje o analytických postupech použitých ke stanovení koncentrací,

dobu a rychlost odstřeďování, pokud se použilo,

koncentrace naměřené při každém stanovení v obou fázích (tzn. uvede se celkem 12 koncentrací),

hmotnost zkušební látky, objem každé fáze použité v každé zkušební nádobě a vypočtené celkové množství zkušební látky, obsažené v jednotlivých fázích po dosažení rovnováhy,

vypočtené hodnoty rozdělovacího koeficientu (P) a střední hodnotu je nutné uvést pro každý soubor zkušebních podmínek, stejně tak střední hodnotu ze všech stanovení. Pokud existují náznaky závislosti rozdělovacího koeficientu na koncentraci, mělo by to být uvedeno ve zprávě,

měla by být uvedena směrodatná odchylka jednotlivých hodnot P od střední hodnoty,

měl by být také uveden dekadický logaritmus střední hodnoty P ze všech stanovení,

vypočtená teoretická hodnota Po/v, byla-li stanovena nebo je-li naměřená hodnota > 104,

pH použité vody a vodné fáze během experimentu,

pokud byly použity pufry, zdůvodnění jejich použití místo vody, jejich složení, koncentrace a pH, pH vodné fáze před a po experimentu.

Pro metodu HPLC:

výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,

zkušební látka a referenční látky, jejich čistota,

teplotní rozmezí při stanoveních,

pH, při kterém se prováděla stanovení,

podrobnosti o analytické a ochranné koloně, o mobilní fázi a o způsobu detekce,

retenční data a hodnoty log P z literatury pro referenční látky použité ke kalibraci,

podrobnosti o proložené regresní přímce (log k versus log P),

průměrná retenční data a interpolovaná hodnota log P pro zkušební sloučeninu,

popis zařízení a pracovních podmínek,

eluční křivky,

množství zkušební látky a referenčních látek zavedených do kolony,

mrtvý čas a způsob jeho měření.

VII.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107. Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) C. Hansch, A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.

(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.): Dostupné: Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

(4) L. Renberg, G. Sundstrӧm, K. Sundh-Nygärd. Chemosphere, 1980,80,683.

(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt, R. Fuerer. Pestic. Sci., 1981, 12, 219(1981).

(6) B. McDuffie. Chemosphere, 1981, vol 10, 73.

(7) W. E. Hammers et al., J. Chromatogr. 1982, 247, 1.

(8) J. E. Haky, A. M. Young. J. Liq. Chromat., 1984, 7. 675.

(9) S. Fujisawa, E. Masuhara. J. Biomed. Mat. Res., 1981, 15, 787.

(10) O. Jubermann. Verteilen und Extrahieren. V: Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (ed. E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.

(11) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Euro. J. Med. Chem. 1979, vol 14, 479.

(12) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, 71, 525.

(13) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant. Elsevier, Amsterdam, 1977.

(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.

(15) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.

(16) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev., 1971, 71, 525.

(17) C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani, E. J. Lien, J. Med Chem. 1973, 16, 1207.

(18) W. B. Neely, D. R. Branson, G. E. Blau. Environ. Sci. Technol. 1974, 8, 1113.

(19) D. S. Brown, E. W. Flagg. J. Environ. Qual. 1981, 10, 382.

(20) J. K. Seydel, K. J. Schaper. Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen. Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

(21) R. Franke. Theoretical Drug Design Methods. Elsevier, Amsterdam 1984.

(22) Y. C. Martin. Quantitative Drug Design. Marcel Dekker, New York, Basel 1978.

(23) N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor. J. Med. Chem. 1976, 19, 615.


DODATEK 1

Metody výpočtu nebo odhadu

ÚVOD

Obecný úvod do výpočtových metod, data a příklady jsou uvedeny v příručce Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).

Vypočtené hodnoty Po/v lze použít

k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná (rozsah u třepací lahve: log Po/v: -2 až 4, rozsah u HPLC: log Po/v: 0 až 6),

k volbě vhodných zkušebních podmínek (např. referenčních látek pro postupy HPLC, poměr objemů n-oktanol/voda pro metodu třepací lahve),

jako vnitřní laboratorní kontrolu možných experimentálních chyb,

k získání odhadu Po/v v případech, kdy zkušební metody nelze z technických důvodů použít.

METODA ODHADU

Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu

Hodnotu rozdělovacího koeficientu je možné odhadnout s použitím rozpustnosti zkušební látky v čistých rozpouštědlech:

Pro tento případ platí:

nasycení coktan-1-ol
Podhad = ————————
nasyceni cvoda

VÝPOČTOVÉ METODY

Podstata výpočtových metod

Všechny výpočtové metody jsou založeny na formálním dělení molekul do vhodných podstruktur, pro něž jsou známy spolehlivé hodnoty přírůstků log Po/v. Hodnota log Po/v celé molekuly se poté vypočte jako součet hodnot pro příslušné fragmenty plus součet korekčních členů pro intramolekulární interakce.

Existují seznamy konstant fragmentů a korekčních členů (b, c, d, e). Některé se pravidelně aktualizují (b).

Kritéria jakostí

Spolehlivost výpočtové metody obecně klesá s rostoucí složitostí zkoumané sloučeniny. V případě jednoduchých molekul s nízkou molekulovou hmotností a jednou nebo dvěma funkčními skupinami lze očekávat, že odchylky hodnot log Po/v získaných různými fragmentačními metodami od naměřené hodnoty budou v rozmezí od 0,1 do 0,3. U složitějších molekul může být rozpětí chyby větší. Závisí to na spolehlivosti a dostupnosti konstant pro fragmenty a rovněž na schopnosti zjistit intramolekulární interakce (např. vodíkové vazby) a na správném používání korekčních členů (což není obtížné při použití počítačového programu CLOGP-3) (b). V případě disociujících látek je důležité správně zohlednit náboj nebo stupeň disociace.

Postupy výpočtu

Hanschova π-metoda

Původní konstanta hydrofobnosti substituentu π zavedená Fujitou et al. (f) je definována jako

πx = log Po/v (PhX) − log Po/v (PhH)

kde Po/v (PhX) je rozdělovací koeficient aromatického derivátu a Po/v (PhH) rozdělovací koeficient výchozí sloučeniny

(např. πCl = log Po/v (C6H5Cl) − log Po/v (C6H6) = 2,84 − 2,13 = 0,71).

Ze své definice je π-metoda použitelná především u aromatických substituentů. Hodnoty π byly pro velký počet substituentů uspořádány do tabulek (b, c, d). Používají se k výpočtu log Po/v aromatických molekul nebo substruktur.

Rekkerova metoda

Podle Rekkera (g) se hodnota log Po/v vypočte takto:

log Po/v = aifi + (interakční člen)
i j

kde fi představuje konstanty různých molekulárních fragmentů a ai četnost jejich výskytu ve vyšetřované molekule. Korekční členy je možné vyjádřit jako souhrnný násobek jediné konstanty Cm (tzv. „magické konstanty“). Konstanty pro molekulární fragmenty fi a Cm byly stanoveny ze seznamu 1 054 experimentálních hodnot Po/v (pro 825 sloučenin) pomocí vícenásobné regresní analýzy (c, h). Interakční členy se určí podle stanovených pravidel popsaných v literatuře (e, h, i).

Hanschova-Leova metoda

Podle Hansche a Lea (c) se hodnota log Po/v vypočte z výrazu:

log Po/v = aifi + bjFj
i j

kde fi představuje konstanty různých molekulárních fragmentů, Fj korekční členy a ai, bj odpovídající četnosti výskytů. Na základě experimentálních hodnot Po/v byl pokusně sestaven seznam hodnot pro atomové a skupinové fragmenty a seznam korekčních členů Fj (tzv. „faktorů“). Korekční členy byly setříděny do několika různých tříd (a, c). Zohlednění všech pravidel a korekčních členů je poměrně složité a časově náročné. Byly vyvinuty sady softwaru (b).

Kombinovaná metoda

Výpočet log Po/v složitých molekul lze značně zdokonalit, jestliže se molekula rozdělí do větších podstruktur, pro něž existují spolehlivé hodnoty pocházející buď z tabulek (b, c), nebo z vlastních měření. Tyto fragmenty (např. heterocykly, antrachinon, azobenzen) lze poté kombinovat s Hanschovými π-hodnotami nebo s Rekkerovými nebo Leovými konstantami pro fragmenty.

Poznámky

i) Výpočetní metody lze použít pro částečně nebo úplně disociované sloučeniny pouze tehdy, lze-li vzít v úvahu nezbytné korekční faktory.

ii) Pokud lze předpokládat přítomnost intramolekulárních vodíkových vazeb, je nutné přičíst odpovídající korekční členy (přibližně 0,6 až 1,0 logaritmu Po/v) (a). O přítomnosti těchto vazeb lze usuzovat z prostorových modelů nebo ze spektroskopických dat molekuly.

iii) Může-li existovat několik tautomerních forem, měla by být jako základ pro výpočet použita nejpravděpodobnější forma.

iv) Pečlivě by měly být sledovány přepracované seznamy konstant fragmentů.

Protokol o zkoušce

Při použití výpočtové metody nebo metody odhadu by měl protokol o zkoušce pokud možno obsahovat následující údaje:

popis látky (směs, nečistoty atd.),

známky přítomnosti intramolekulárních vodíkových vazeb, disociace, nábojů a dalších neobvyklých efektů (např. tautomerie),

popis výpočtové metody,

označení nebo uvedení databáze,

zvláštnosti při volbě fragmentů,

vyčerpávající dokumentaci výpočtů.

LITERATURA

(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. McGraw-Hill, New York, 1983.

(b) Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). Pomona College. Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA.

(c) C. Hansch, A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.

(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev. 1971, 71, 525

(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Eur. S. Med. Chem. - Chim. Ther. 1979, 14, 479.

(f) T. Fujita, J. Iwasa, C. Hansch. J. Amer. Chem. Soc., 1964, 86, 5175.

(g) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library. Elsevier, New York, 1977, 1.

(h) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.

(i) R. A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, 225.


DODATEK 2

Doporučené referenční látky pro metodu HPLC

ČísloReferenční látkalog Po/vpKa
1butan-2-on0,3
24-acetylpyridin0,5
3anilin0,9
4acetanilid1,0
5benzylalkohol1,1
64-methoxyfenol1,3pKa = 10,26
7kyselina fenoxyoctová1,4pKa = 3,12
8fenol1,5pKa = 9,92
92,4-dinitrofenol1,5pKa = 3,96
10benzonitril1,6
11fenylacetonitril1,6
124-methylbenzylalkohol1,6
13acetofenon1,7
142-nitrofenol1,8pKa = 7,17
15kyselina 3-nitrobenzoová1,8pKa = 3,47
164-chloranilin1,8pKa = 4,15
17nitrobenzen1,9
183-fenylpropan-2-ol1,9
19kyselina benzoová1,9pKa = 4,19
20p-kresol1,9pKa= 10,17
21kyselina skořicová2,1pKa = 3,89 cis
4,44 trans
22anisol2,1
23methyl-benzoát2,1
24benzen2,1
25kyselina 3-methylbenzoová2,4pKa = 4,27
264-chlorfenol2,4pKa = 9,l
27trichlorethylen2,4
28atrazin2,6
29ethyl-benzoát2,6
302,6-dichlorbenzonitril2,6
31kyselina 3-chlorbenzoová2,7pKa = 3,82
32toluen2,7
33naftalen-1-ol2,7pKa = 9,34
342,3-dichloranilin2,8
35chlorbenzen2,8
36allylfenylether2,9
37brombenzen3,0
38ethylbenzen3,2
39benzofenon3,2
404-fenylfenol3,2pKa = 9,54
41thymol3,3
421,4-dichlorbenzen3,4
43difenylamin3,4pKa = 0,79
44naftalen3,6
45fenyl-benzoát3,6
46isopropylbenzen3,7
472,4,6-trichlorfenol3,7pKa = 6
48bifenyl4,0
49benzyl-benzoát4,0
502,4-dinitro-6-sek-butylfenol4,1
511,2,4-trichlorbenzen4,2
52kyselina dodekanová4,2
53difenylether4,2
54n-butylbenzen4,5
55fenanthren4,5
56fluoranthen4,7
57dibenzyl4,8
582,6-difenylpyridin4,9
59trifenylamin5,7
60DDT6,2
Jiné referenční látky s nízkou hodnotou log Po/v
1kyselina nikotinová-0,07

VIII. METODA PRO STANOVENÍ VÝBUŠNÝCH VLASTNOSTÍ - metoda A.14 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

VIII.1 METODA

VIII.1.1 ÚVOD

Metoda pro zjišťování výbušnosti látky stanovuje zkušební postup pro zjištění, zda látka je z hlediska výbuchu citlivá na působení tepla, na náraz nebo na tření, a to za podmínek uvedených v této metodě.

Metoda poskytuje údaje pro ohodnocení možnosti vyvolání výbuchu působením uvedených podnětů; neslouží však ke zjištění, zda je látka schopna vybuchovat za jakýchkoliv podmínek.

Látka se podrobí následujícím zkouškám

a) zkoušce citlivosti na působení tepla,

b) zkoušce citlivosti na náraz,

c) zkoušce citlivosti na tření,

Při uvedených zkouškách lze použít i alternativní přístroje, a to za podmínky, že jsou mezinárodně uznávané a že jimi získané výsledky odpovídají výsledkům získaným na přístrojích uvedených v příloze.

Zkoušky se neprovádějí, lze-li u látky na základě odborného posouzení vyslovit jednoznačný závěr, že se látka nemůže rychle rozkládat za vývoje plynů a uvolňování tepla a nepředstavuje tedy nebezpečí výbuchu.

VIII.1.2 DEFINICE A REFERENČNÍ LÁTKY

Pro účely této vyhlášky se považuje za výbušnou látku taková chemická látka nebo chemický přípravek, která je schopna vybuchnout působením tepla nebo která z hlediska možnosti vybuchnout je citlivá na náraz nebo na tření v přístroji uvedeném v příloze nebo je citlivější na náraz nebo na tření než 1,3-dinitrobenzen v alternativním přístroji,

Za referenční látku se považuje

a) krystalický 1,3-dinitrobenzen, který prochází sítem o velikosti oka 0,5 mm, a to pro zkoušení citlivosti na náraz a na tření,

b) perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (označovaný jako RDX nebo hexogen nebo cyklonit - CAS 121-82-4) rekrystalovaný z vodného cyklohexanonu, prosátý za mokra na sítě 250 μm a zachycený na sítě 150 μm, sušený při 103 ± 2 °C po dobu 4 hodin, pro druhou sérii zkoušek.

VIII.1.3 PRINCIP METODY

VIII.1.3.1 Předběžná zkouška

Před provedením zkoušek se pro zajištění bezpečnosti provádí předběžná zkouška.

Předběžná zkouška se provádí s velmi malými vzorky látky, přibližně 10 mg, a to zahříváním neuzavřené látky v plameni plynového hořáku, nárazem v jakémkoliv zařízení a třením za použití paličky proti podložce nebo v jiném zařízení pro zkoušení citlivosti na tření. Účelem předběžné zkoušky je zjistit, zda látka není tak citlivá a výbušná, že předepsanou zkoušku citlivosti, zvláště zkoušku citlivosti na působení tepla, je nutné provádět za použití ochranných opatření, která by zamezila poranění osoby provádějící zkoušku.

Výsledky předběžné zkoušky neslouží k hodnocení výbušnosti látky.

VIII.1.3.2 Zkouška citlivosti na působení tepla

Při této zkoušce se látka zahřívá v ocelové trubce uzavřené clonami. Při této zkoušce se zjišťuje, zda je látka náchylná k výbuchu za podmínek intenzivního zahřívání a předepsaného utěsnění.

VIII. 1.3.3 Zkouška citlivosti na náraz

Při této zkoušce se látka zkouší závažím předepsané hmotnosti, které se spouští z předepsané výšky.

VIII.1.3.4 Zkouška citlivosti na tření

Při této zkoušce se pevná nebo pastovitá látka zkouší třením mezi standardními povrchy za předepsaných podmínek zatížení a vzájemného pohybu. U kapalin se zkouška třením neprovádí.

VIII.1.4 POPIS METODY

VIII.1.4.1 Zkouška citlivosti na působení tepla

VIII.1.4.1.1 Zařízení

Zařízení je tvořeno ocelovou trubkou k jednomu použití se znovupoužitelným uzavíracím zařízením (obrázek 1) instalovanou v ohřívacím a ochranném zařízení. Každá trubka je hlubokotažená z ocelového plechu. Její vnitřní průměr je 24 mm, délka 75 mm a tloušťka stěny 0,5 mm. Na otevřeném konci trubky je příruba sloužící k uzavření trubky sestavou clony. Sestava je tvořena clonou se středovým otvorem odolnou vůči tlaku připevněnou k trubce pomocí dvoudílného šroubového spoje (matice a závitová příruba). Matice a závitová příruba jsou zhotoveny z chrom-manganové oceli, která je do 800 °C nejiskřivá. Clony mají tloušťku 6 mm, jsou vyrobeny ze žáruvzdorné oceli a tvoří řadu podle velikosti otvorů.

VIII.1.4.1.2 Podmínky zkoušky

Látka se obvykle zkouší ve stavu, v jakém je dodána. V některých případech, např. když je lisovaná, litá nebo jiným způsobem zhutněná, může být zkoušena po rozdrcení.

U pevných látek se hmotnost látky použité v každé zkoušce určí ve dvou etapách. V první etapě se zvážená trubka naplní 9 cm3 látky a po celém průřezu trubky se látka stlačí silou 80 N. Z bezpečnostních důvodů nebo v případech, kdy stlačováním může dojít ke změně fyzikální formy vzorku, lze použít jiný způsob plněni; například je-li látka velmi citlivá na tření, není vhodné její stlačování. Je-li látka stlačitelná, přidá se další množství této látky a stlačuje se, až je trubka zaplněna do vzdálenosti 55 mm od horního okraje. Zjistí se celkové množství látky použité pro naplnění do úrovně 55 mm od horního okraje a přidají se další 2 podíly látky, přičemž každý se stlačí silou 80 N. Látka se pak podle potřeby buď přidá a stlačí, nebo odebere tak, aby trubka byla naplněna do úrovně 15 mm od horního okraje. Zjištěná celková hmotnost látky je základem pro provedení druhé etapy. Při ní se nejprve vnese do trubky třetina z hmotnosti zjištěné v první etapě a stlačí se. Vnesou se další 2 podíly, stlačí se silou 80 N a podle potřeby se přidá nebo odebere látka v trubce na úroveň 15 mm od horního okraje trubky. Množství pevné látky zjištěné ve druhé etapě se použije pro každý pokus; naplnění se provede se 3 stejnými množstvími a každé z nich se stlačí na objem 9 cm3 bez ohledu na to, jaké síly bude zapotřebí. Pro usnadnění lze k tomu použít rozpěrné kroužky.

Kapaliny a gely se naplní do trubky do výšky 60 mm. Zvláštní pozornost je třeba věnovat gelům, aby nedošlo k tvorbě dutin. Zezdola se na trubku navleče závitová příruba, vloží se vhodná clona a po nanesení mazadla na bázi disulfidu molybdeničitého se matice utáhne. Je nutné se přesvědčit, zda nějaká látka nezůstala zachycena mezi přírubou a clonou nebo v závitech.

Naplněná a uzavřená trubka se zahřívá propanem odebíraným přes průtokoměr z průmyslové tlakové láhve s regulátorem tlaku seřízeným na rozmezí 6 až 7 kPa. Propan se rozděluje rozdělovacím potrubím stejnoměrně do 4 hořáků, což se ověří vizuálně pozorováním plamenů hořáků. Hořáky jsou umístěny kolem zkušební trubky (obrázek 1). 4 hořáky mají celkovou spotřebu přibližně 43,2 dm3 propanu za minutu. Lze použít alternativní palivo a hořáky, avšak rychlost ohřevu musí být stejná, jak je uvedeno na obrázku 3. U všech zařízení se musí pravidelně kontrolovat rychlost ohřevu za použití trubek naplněných dibutylftalátem (obrázek 3).

VIII.1.4.1.3 Provedení zkoušky

Každá zkouška se provádí do roztržení trubky nebo až doba ohřevu dosáhne 5 minut. Nejprve se provede série 3 zkoušek s clonou o průměru otvoru 6 mm, a pokud nedojde k výbuchu, provede se druhá série 3 zkoušek s clonou o průměru otvoru 2 mm. Dojde-li k výbuchu u kterékoliv zkušební série, nevyžadují se další zkoušky.

Projevem výbuchu je roztržení trubky na 3 nebo více částí, z nichž některé mohou být vzájemně spojeny úzkými proužky kovu (obrázek 2). Zkouška, při níž se vytvoří méně částí nebo nevzniknou žádné části, se považuje za zkoušku, při níž nedošlo k výbuchu.

VIII.1.4.1.4 Vyhodnocení zkoušky

Zkouška se považuje za pozitivní, pokud dojde k výbuchu u kterékoliv zkušební série.

VIII.1.4.2 Zkouška citlivostí na náraz

VIII.1.4.2.1 Zařízení

Základními částmi obvyklých zařízení s padacím kladivem je blok z šedé litiny s podstavcem, podložka (kovadlina), sloup, vodicí lišty, padací závaží (kladivo), zadržovací a uvolňovací zařízení a držák vzorku (obrázek 4). Ocelová podložka (kovadlina) o průměru 100 mm a výšce 70 mm je přišroubována k horní straně ocelo-litinového bloku o délce 230 mm, šířce 250 mm a výšce 200 mm. se základovou (litinovou) deskou o délce 450 mm, šířce 450 mm a výšce 60 mm. Sloup tvořený bezešvou taženou ocelovou trubkou je připevněn držákem přišroubovaným na zadní stranu ocelo-litinového bloku. 4 šrouby ukotvují zařízení k betonovému bloku o rozměrech 60 × 60 × 60 cm takovým způsobem, že vodicí lišty jsou přesně kolmo a padací závaží padá volně. Vhodné je použít závaží o hmotnosti 5 a 10 kg z pevné oceli. Úderová hlava každého závaží je z tvrzené oceli HRC 60 až 63 o minimálním průměru 25 mm.

Zkoušený vzorek se uzavře do zkušebního přípravku tvořeného 2 souosými ocelovými válci umístěnými nad sebou a vodicím pouzdrem tvořeným dutým ocelovým válcem. Plné ocelové válce o průměru mezi 10 - 0,003 mm a 10 - 0,005 mm a výšce 10 mm mají vyleštěné plochy, zakulacené hrany s poloměrem zakřivení 0,5 mm a tvrdost HRC 58 až 65. Dutý válec musí mít vnější průměr 16 mm, vyleštěný vyvrtaný otvor o průměru mezi 10 + 0,005 mm a 10 + 0,010 mm a výšku 13 mm. Sestavený zkušební přípravek se umístí na výměnnou mezipodložku o průměru 26 mm a výšce 26 mm, který je vystředěn středícím kroužkem s otvory pro odvod dýmů.

VIII.1.4.2.2 Podmínky zkoušky

Objem vzorku činí 40 mm3 nebo takový objem, který je vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se následujícím způsobem:

a) práškové látky se prosejí sítem o velikosti oka 0,5 mm; ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem,

b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; pro zkoušení látky se jako reprezentativní vzorek původní látky použije prosetý podíl o velikosti částic od 0,5 mm do 1 mm.

Látky dodávané ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu nebo po odstranění nejvýše možného množství ředidla. Kapalné látky se zkoušejí s mezerou 1 mm mezi horním a dolním ocelovým válcem.

VIII.1.4.2.3 Provedení zkoušky

U série 6 zkoušek se pustí závaží o hmotnosti 10 kg z výšky 0,40 m (40 J). Dojde-li během těchto 6 zkoušek při 40 J k výbuchu, musí se provést další série 6 zkoušek s puštěním závaží o hmotnosti 5 kg z výšky 0,15 m (7,5 J). V jiných zařízeních se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. postup up-and-down).

VIII.1.4.2.4 Vyhodnocení zkoušky

Výsledek se považuje za pozitivní, jestliže se při kterékoliv zkoušce nejméně jednou zaznamená výbuch (třesk nebo plamen), nebo při zkouškách v jiných zařízeních je zkoušená látka citlivější než 1,3-dinitrobenzen nebo RDX.

VIII.1.4.3 Zkouška citlivosti na tření

VIII.1.4.3.1 Provedení

Třecí zařízení (obrázek 5) je tvořeno základovou deskou z lité oceli, na které je upevněno třecí zařízení. To je tvořeno nepohyblivým porcelánovým kolíkem a pohyblivou porcelánovou destičkou. Porcelánová destička je upevněna na saních vedených 2 vodícími lištami. Saně jsou připojeny k elektromotoru ojnicí, excentrickou vačkou a vhodným ozubeným převodem tak, že porcelánová destička vykonává pod porcelánovým kolíkem pohyb tam a zpět na délce dráhy 10 mm. Porcelánový kolík se může zatížit silou buď 120 N, nebo 360 N.

Rovné porcelánové destičky jsou vyrobeny z bílého technického porcelánu o drsnosti 9 až 32 μm o délce 25 mm, šířce 25 mm a výšce 5 mm. Válcový porcelánový kolík je rovněž vyroben z bílého technického porcelánu a má délku 15 mm a průměr 10 mm a zdrsněné kulové plochy s poloměrem zakřivení 10 mm.

VIII.1.4.3.2 Podmínky zkoušky

Objem vzorku činí 10 mm3 nebo takový objem, který je vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se následujícím způsobem:

a) práškové látky se prosejí sítem o velikosti oka 0,5 mm; ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem,

b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; pro zkoušení látky se použije prosetý podíl o velikosti částic menší než 0,5 mm.

Látky dodávané ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu. Není-li možné připravit látku v suchém stavu, zkouší se pasta, a to po odstranění nejvýše možného množství ředidla, ve formě proužku o tloušťce 0,5 mm, šířce 2 mm a délce 10 mm připraveného v tvarovací formě.

VIII.1.4.3.3 Provedení zkoušky

Porcelánový kolík se přiloží na zkoušený vzorek a zatíží se. Při provádění zkoušky musí být rýhy v porcelánové destičce příčně ke směru pohybu. Je nutné dbát na to, aby kolík zůstal na vzorku, aby pod kolíkem zůstalo ležet dostatečné množství vzorku a také aby se destička pohybovala správně pod kolíkem. U pastovitých látek se pro nanesení látky na destičku používá měrka 0,5 mm silná s otvorem 2 × 10 mm. Porcelánová destička se musí pohybovat pod porcelánovým kolíkem po dráze 10 mm tam a zpět za 0,44 s. Každá část povrchu destičky a kolíku se smí použít pouze jednou; 2 konce každého kolíku slouží pro 2 pokusy a každá ze 2 stran destičky slouží pro 3 pokusy.

Série 6 zkoušek se provádí se zatížením 360 N. Získá-li se pozitivní výsledek během těchto 6 zkoušek, musí se provést další série 6 zkoušek se zatížením 120 N. U jiných zařízení se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. postup up-and-down).

VIII.1.4.3.4 Vyhodnocení zkoušky.

Výsledek se považuje za pozitivní, jestliže se nejméně jednou zaznamená výbuch (třesk, praskání, jiskření nebo plamen) při kterékoliv zkoušce nebo zkoušená látka splňuje ekvivalentní kritéria v jiných zkouškách.

VIII.2 DATA

Zkoušená látka se považuje za výbušnou ve smyslu zákona, pokud se při její zkoušce citlivosti na působení tepla, náraz nebo tření získá pozitivní výsledek.

VIII.3 ZPRÁVA

Zpráva o zkoušce obsahuje, pokud je to možné, zejména následující informace:

a) identifikaci, chemické složení, čistotu a vlhkost zkoušené látky,

b) fyzikální formu vzorku a informace, zda se vzorek drtil, mlel nebo proséval,

c) údaje zjištěné při zkoušce citlivosti na působení tepla, například hmotnost vzorku a počet úlomků,

d) pozorované jevy při zkoušce citlivosti na náraz nebo při zkoušce citlivosti na tření, například tvorba značného množství dýmu nebo úplný rozklad, plameny, jiskry, třesk nebo praskání,

e) výsledky každého typu zkoušky,

f) zdůvodnění použiti alternativního přístroje a důkaz srovnatelnosti získaných výsledků s výsledky získanými s přístrojem uvedeným v této metodě,

g) poznámky, které mohou mít význam pro správné hodnocení výsledků, například odkazy na zkoušky podobných látek,

h) další poznámky, které mají vztah k interpretaci výsledků.

Ve zprávě o zkoušce se uvádí také všechny výsledky, které jsou považovány za chybné, anomální nebo nereprezentativní. Jestliže byly některé hodnoty vyřazeny, je nutné podat vysvětlení a uvést všechny výsledky náhradních nebo doplňkových zkoušek. Pokud není možno anomální výsledek kvalifikovaně vysvětlit, je třeba jej přijmout tak, jak byl dosažen, a látku ohodnotit způsobem odpovídajícím dosaženému výsledku.

VIII.4 LITERATURA

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.

(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6 - 13 a 30 - 42.

(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of explosive risk.

Obrázek 1

Zařízení na zkoušku citlivosti na působení tepla

(všechny rozměry v mm)

Obr. 1a Ocelová trubka a příslušenství

Obr. 1a Ocelová trubka a příslušenství

(1) trubka

(2) prstenec se závitem; závit pro nízké tření

(3) clona o průměru a=2,0 nebo 6,0 mm

(4) matice s otvorem o průměru b=10 mm

(5) zkosená hrana

(6) 2 rovné plošky pro klíč 41

(7) 2 rovné plošky pro klíč 36

Obr. 1b Ohřívací a ochranné zařízení

Obr. 1b Ohřívací a ochranné zařízení

(8) ochranný kryt odolný vůči střepinám

(9) 2 tyčinky nesoucí trubku

(10) sestavená trubka

(11) poloha zadního hořáku, ostatní hořáky jsou viditelné

(12) zapalovací hořáček

Obrázek 2

Zkouška citlivosti na působení tepla

Příklady roztržení trubky

Příklady roztržení trubky

Obrázek 3

Kalibrace rychlosti ohřevu pro zkoušku citlivosti na působení tepla

Kalibrace rychlosti ohřevu pro zkoušku citlivosti na působení tepla

Obrázek 4

Přístroj pro zkoušku citlivosti na náraz

(všechny rozměry v mm)

Obr. 4a Padací kladivo, čelní a boční celkový pohled

Obr. 4a Padací kladivo, čelní a boční celkový pohled

(1) základová deska 450×450×60

(2) ocelo-litinový blok 230×250×200

(3) kovadlina, průměr 100×70

(4) sloup

(5) střední nosník

(6) dvě vodicí lišty

(7) ozubená tyč

(8) měřítko

Obr. 4b Padací kladivo, spodní část

Obr. 4a Padací kladivo, spodní část

(9) padací kladivo

(10) zadržovací a uvolňovací zařízení

(11) středící objímka

(12) mezipodložka (výměnná), o průměru 26x26

(13) středící kroužek s otvory

(14) zkušební přípravek

Obr. 4c Zařízení pro zkoušku citlivosti práškových a pastovitých látek vůči mechanickému podnětu na úder

Obr. 4c Zařízení pro zkoušku citlivosti práškových a pastovitých látek vůči mechanickému podnětu na úder

(1) ocelové válečky

(2) vodící pouzdro pro ocelové válečky

(3) středící kroužek s otvory

a) svislý řez

b) průmět

Obr. 4d Zařízení pro zkoušku citlivosti kapalné látky vůči mechanickému podnětu na úder

Obr. 4d Zařízení pro zkoušku citlivosti kapalné látky vůči mechanickému podnětu na úder

(4) pryžový prstenec

(5) kapalná látka (40 mm3)

(6) prostor bez kapaliny

Obr. 4e Kladivo (závaží 5 kg)

Obr. 4e Kladivo (závaží 5 kg)

(1) upínací čep

(2) polohová značka

(3) vodící drážky

(4) úderník

(5) aretační zařízení

Obrázek 5

Přístroj pro zkoušku citlivosti na tření

Obr. 5a Třecí přistroj; boční a půdorysný pohled

Obr. 5a Třecí přistroj; boční a půdorysný pohled

(1) ocelový podstavec

(2) pohyblivé sáně

(3) porcelánová destička 25x25x5 mm, upevněná na saních

(4) upevněný porcelánový kolík, průměr 10 mm, délka 15 mm

(5) zkoušený vzorek, 10 mm3

Obr. 5b Výchozí poloha válečku na vzorku

Obr. 5b Výchozí poloha válečku na vzorku

(6) držák kolíku

(7) zatěžovací rameno

(8) vyrovnávací závaží

(9) vypínač

(10) kolečko pro nastavení saní do výchozí polohy

(11) směr k elektromotoru

IX. METODA PRO STANOVENÍ ČÍSELNĚ STŘEDNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ - metoda A.18 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po čtyřiadvacáté přizpůsobuje technickému pokroku směrnici Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 98/73/ES“)

XI.1. METODA

Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkaze 1.

XI.1.1 Úvod

Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.

IX.1.2 Definice a jednotky

Číselně střední molekulová hmotnost Mn a hmotnostně střední molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí následujících rovnic:

vzorec

kde

Hi je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem Vi,

Mi je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi, a n je počet dat.

Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.

IX.1.3 Referenční látky

Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.

Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.

IX.1.4 Princip zkušební metody

Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).

Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

IX.1.5 Kritéria kvality

Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je-li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1).

Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami

Mp < 2 000 Mw/Mn < 1,20
2000 = MP =106 Mw/Mn < 1,05
Mp > 106 Mw/Mn < 1,20

(Mp je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)

XI.1.6 Popis zkušební metody

IX.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu

Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30x7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

IX.1.6.2 Příprava roztoku vzorku

Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.

Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

IX.1.6.3 Přístroje a pomůcky

zásobník rozpouštědla,

odplynovací zařízení (podle potřeby),

čerpadlo,

tlumič rázů (podle potřeby),

vstřikovací systém,

chromatografické kolony,

detektor,

průtokoměr (podle potřeby),

zapisovač,

nádoba na odpad.

Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

IX. 1.6.4 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

IX.1.6.5 Kolona

Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

IX.1.6.6 Teoretická patra

Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí

vzorec

kde

N je počet teoretických pater,

Ve je eluční objem v maximu píku,

W šířka základny píku,

W½ šířka píku v polovině výšky.

IX.1.6.7 Separační účinnost

Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:

vzorec

kde

Ve,Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx,

Ve(10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.

Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

Ve1 − Ve21
R1,2 = 2 × ———— × ——————
W1 + W2log10 (M2/M1)

kde

Ve1,Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,

W1, W2 jsou šířky základen píků,

M1, M2 molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).

Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

IX.1.6.8 Rozpouštědla

Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

IX.1.6.9 Kontrola teploty

Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

IX.1.6.10 Detektor

Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.

IX.2 DATA A ZPRÁVY

IX.2.1 Data

Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).

Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.

Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n-hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Číselně střední a hmotnostně střední molekulová hmotnost se obecně stanoví elektronickým zpracováním dat založeným na vzorcích v bodě 1.2. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.

IX.2.2 Protokol o zkoušce

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

IX.2.2.1 Zkušební látka

dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),

popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.

IX.2.2.2 Vybavení

zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,

čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,

separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),

počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),

informace o symetrii píků,

teplota kolony, způsob kontroly teploty,

detektor (princip měření, typ, objem kyvety),

průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),

systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).

IX.2.2.3 Kalibrace systému

podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,

informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),

informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,

všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:

název vzorku,

výrobce vzorku,

charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,

vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,

hodnota Mp použitá po kalibraci,

eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,

hodnota Mp vypočtená pro maximum píku,

chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech.

IX.2.2.4 Hodnocení

hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),

informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,

informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,

popis metody hlazení, bylo-li použito,

příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,

popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,

vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),

pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,

podrobný popis všech změn zkušebních postupů,

podrobnosti o rozsahu chyb,

jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.

IX.3 LITERATURA

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

PŘÍLOHA

Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (Mn) polymerů

Gelová permeační chromatografie (GPC) je přednostní metodou stanovení Mn, zejména tehdy, je-li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává-li se, že látka nevyhoví regulačním kritériím na Mn (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:

1. Použití koligativních vlastností

1.1 Ebulioskopie/kryoskopie: spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného polymeru na bod varu/bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1), (2).

Použitelnost: Mn < 20 000.

1.2 Snížení tlaku par: spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1), (2).

Použitelnost: Mn < 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený význam).

1.3 Membránová osmometrie: spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a ustavit rovnováhu. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1), (3), (4).

Použitelnost: Mn od 20 000 do 200 000.

1.4 Osmometrie - tlak páry: spočívá ve srovnání rychlosti vypařování čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1), (5), (6).

Použitelnost: Mn < 20 000.

2. Analýza koncových skupin

Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací/derivatizací). Stanovení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7), (8),(9).

Použitelnost: Mn až do 50 000 (s klesající spolehlivostí).

LITERATURA

(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York.

(2) Glover C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.

(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recomended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons.

(7) Schröder, E., Müller, G., Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

X. METODA PRO STANOVENÍ OBSAHU MOLEKUL O NÍZKÉ HMOTNOSTI V POLYMERECH - metoda A.19 podle přílohy směrnice 98/73/ES

X.1 METODA

Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech.

X.1.1 Úvod

Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.

X.1.2 Definice a jednotky

Nízká molekulová hmotnost je účelově definována jako molekulová hmotnost pod 1 000 daltonů.

Číselně střední molekulová hmotnost Mn a hmotnostně střední molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí následujících rovnic:

vzorec

kde

Hi je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem Vi,

Mi je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi, a

n je počet dat.

Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.

X.1.3 Referenční látky

Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.

Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními, hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.

X.1.4 Princip zkušební metody

Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).

Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

X.1.5 Kritéria kvality

Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je-li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1). Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami

Mp < 2 000 Mw/Mn < 1,20
2 000 = MP = 106 Mw/Mn < 1,05
Mp > 106 Mw/Mn < 1,20

(Mp je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)

X.1.6 Popis zkušební metody

X.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu

Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30x7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

X.1.6.2 Příprava roztoku vzorku

Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.

Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

X.1.6.3 Korekce na obsah nečistot a přísad

Korekce obsahu frakce s M < 1 000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických složek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není-li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.

V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedena za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.

X.1.6.4 Přístroje a pomůcky

Aparatura pro GPC sestává z následujících součástí:

zásobník rozpouštědla,

odplynovací zařízení (podle potřeby), čerpadlo,

tlumič rázů (podle potřeby),

vstřikovací systém,

chromatografické kolony,

detektor,

průtokoměr (podle potřeby),

zapisovač,

nádoba na odpad.

Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

X.1.6.5 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

X.1.6.6 Kolona

Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

X.1.6.7 Teoretická patra

Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí

vzorec

kde

N je počet teoretických pater,

Ve je eluční objem v maximu píku,

W šířka základny píku,

W½ šířka píku v polovině výšky.

X.1.6.8 Separační účinnost

Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:

vzorec

kde

Ve Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx,

Ve(10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.

Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

Vel − Ve21
R1,2 = 2 × ———— × ——————
W1 + W2log10 (M2/M1)

kde

Ve1, Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,

W1, W2 jsou šířky základen píků, M1, M2 molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).

Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

X.1.6.9 Rozpouštědla

Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

X.1.6.10 Kontrola teploty

Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

X.1.6.11 Detektor

Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by. být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.

X.2 DATA A ZPRÁVY

X.2.1 Data

Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).

Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také data ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek.

Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n-hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část. křivky odpovídající molekulovým hmotnostem nižším než 1 000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování dat. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce a pokud by to nebylo zohledněno, vedlo by to k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze.

Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.

X.2.2 Protokol o zkoušce

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

X.2.2.1 Zkušební látka

dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),

popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.

X.2.2.2 Vybavení

zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,

čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,

separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),

počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),

informace o symetrii píků,

teplota kolony, způsob kontroly teploty,

detektor (princip měření, typ, objem kyvety),

průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),

systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).

X.2.2.3 Kalibrace systému

podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,

informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),

informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,

všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:

název vzorku,

výrobce vzorku,

charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,

vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,

hodnota Mp použitá po kalibraci,

eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,

hodnota Mp vypočtená pro maximum píku,

chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech.

X.2.2.4 Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností v polymeru

popis metod použitých v analýze a způsobu, jakým byly experimenty provedeny,

informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností vyjádřeném v procentech celkového vzorku (m/m),

informace o nečistotách, přísadách a jiných nepolymerních podílech vyjádřených v procentech celkového vzorku (m/m).

X.2.2.5 Hodnocení

hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),

informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,

informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,

popis metody hlazení, bylo-li použito,

příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,

popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,

vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),

pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,

podrobný popis všech změn zkušebních postupů,

podrobnosti o rozsahu chyb,

jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.

X.3 LITERATURA

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modem Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

PŘÍLOHA

Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru

Je-li ve vzorku přítomen nerozpuštěný polymer, vede to ke ztrátě hmotnosti během analýzy GPC. Nerozpuštěné polymery jsou nevratně zachyceny v koloně nebo na filtru při filtrování vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku kolonou projde. V případě, že lze odhadnout nebo změřit přírůstek indexu lomu (dn/dc) polymeru, lze odhadnou ztrátu hmotnosti vzorku na koloně. V takovém případě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardním materiálem o známé koncentraci a známé hodnotě dn/dc, čímž se provede kalibrace refraktometru. V příkladě uvedeném dále je jako standard použit polymethylmethakrylát (pMMA).

Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylátů se analyzuje metodou GPC standard pMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledná data se použijí pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice:

K = R/(C × V × dn/dc)

kde

K je konstanta refraktometru (μVs/ml),

R je odečet pro standard pMMA (μVs),

C je koncentrace standardu pMMA (mg/ml),

V je nastříknutý objem (ml) a

dn/dc je přírůstek indexu lomu pro pMMA v tetrahydrofuranu (ml/mg).

Pro standard pMMA jsou typická následující data:

R = 2 937 891

C = 1,07 mg/ml

V = 0,1 ml

dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg.

Výsledná hodnota K, 3,05x1011 se =poté použije pro výpočet teoretické odezvy detektoru v případě, že detektorem prošlo 100 % vstřiknutého polymeru.

XI. METODA PRO STANOVENÍ CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ / EXTRAKCI VE VODĚ - metoda A.20 podle přílohy směrnice 98/73/ES

XI.1. METODA

Popsaná metoda je replikou revidované verze metody OECD TG 120 (1997). Další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).

XI.1.1 Úvod

V případě určitých polymerů, např. emulzních polymerů, může být před použitím dále popsané metody nezbytná předběžná úprava. Tato metoda není použitelná pro kapalné polymery a pro polymery, které za zkušebních podmínek reagují s vodou.

Není-li metoda použitelná nebo proveditelná, je možné zkoumat chování polymerů při rozpouštění a extrakci jinými metodami. V takových případech by měly být uvedeny všechny podrobnosti použité metody a její zdůvodnění.

XI.1.2 Referenční látky

Nejsou.

XI.1.3 Princip zkušební metody

Chování polymerů při rozpouštění/extrakci ve vodném prostředí se zjišťuje baňkovou metodou (viz A.6, rozpustnost ve vodě, baňková metoda) s úpravou uvedeno dále.

XI.1.4 Kritéria kvality

Nejsou.

XI.1.5 Popis zkušební metody

XI.1.5.1 Zařízení

Pro provedení metody je nezbytné následující zařízení:

drticí zařízení, např. mlýnek pro přípravu částic o známé velikosti,

třepačka s možností kontroly teploty,

membránový filtrační systém,

vhodné analytické vybavení,

normalizovaná síta.

XI.1.5.2 Příprava vzorku

Reprezentativní vzorek musí být nejdříve omezen za použití vhodného síta na velikost částic 0,125 až 0,25 mm. Kvůli stálosti vzorku nebo kvůli procesu drcení může být nezbytné chlazení. Gumovité materiály mohou být drceny při teplotě kapalného dusíku (1).

Nelze-li požadované velikosti částic dosáhnout, mělo by se postupovat tak, aby byla velikost částic zmenšena co nejvíce, a výsledky by měly být uvedeny. Ve zprávě je nezbytné uvést, jak byl nadrcený vzorek uchován do provedení zkoušky.

XI.1.5.3 Postup

Do každé ze tří nádob opatřených skleněnými zátkami se naváží po 10 gramech zkušební látky a přidá se po 1 000 ml vody. Ukáže-li se zpracování 10 g polymeru neschůdným, mělo by být použito nejbližší vyšší množství, které lze zpracovat, a objem vody by měl být odpovídajícím způsobem upraven. Nádoby se těsně zazátkují a poté se třepou při 20 °C. Měly by být použita třepačka nebo míchačka schopná pracovat při konstantní teplotě. Po 24 hodinách se obsah každé nádoby odstředí nebo zfiltruje a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace polymeru. Nejsou-li k dispozici vhodné analytické metody pro vodnou fázi, lze celkovou rozpustnost/extrahovatelnost zhodnotit z hmotnosti suchého zbytku na filtru nebo ze usazeniny po odstředění.

Obvykle je nezbytné kvantitativně rozlišit nečistoty a přísady na jedné straně, a podíl o nízké molekulové hmotnosti na druhé straně. V případě vážkového stanovení je také důležité provést slepý pokus bez použití zkušební látky, s cílem zohlednit zbytky pocházející z experimentálního postupu.

Chování při rozpouštění/extrakci polymerů ve vodě při 37 °C a pH 2 a 9 může být stanoveno způsobem popsaným v případě provádění experimentu při 20 °C. Hodnot pH lze dosáhnout přidáním buď vhodných tlumivých roztoků, nebo vhodných kyselin nebo zásad, např. kyseliny chlorovodíkové, kyseliny octové, hydroxidu sodného nebo draselného analytické čistoty nebo NH3.

V závislosti na použité metodě by měla být provedena jedna nebo dvě zkoušky, jsou-li k dispozici dostatečně specifické metody pro přímou analýzu vodné fáze na obsah polymeru, měla by stačit jedna zkouška, jak je uvedena výše. Nejsou-li však takové metody k dispozici a zjištění chování polymeru při rozpouštění/extrakci je omezeno na přímou analýzu stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) ve vodném extraktu, měla by být provedena dodatečná zkouška. Zkouška by měla být rovněž provedena třikrát, přičemž se použije 10krát menší množství vzorků polymeru a stejné množství vody jako v první zkoušce.

XI.1.5.4 Analýza

XI.1.5.4.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku

Je možné, že jsou k dispozici metody pro přímou analýzu složek polymeru ve vodné fázi. V opačném případě lze také zvážit nepřímou analýzu rozpuštěných/extrahovaných složek polymeru stanovením celkového obsahu rozpustných složek a provedením korekce na obsah složek, které nejsou specifické pro polymer.

Analýza vodné fáze na obsah celkového polymerního podílu je možná buď dostatečně citlivou metodou, např.

stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) rozkladem peroxodisíranem nebo dichromanem za účelem uvolnění CO2 a následnou IR analýzou nebo chemickou analýzou,

atomovou absorpční spektrometrií (AAS) nebo jejím protějškem spektrometrií s indukčně vázanou plazmou (ICP) v případě silikonu nebo polymerů obsahujících kov,

UV absorpcí nebo spektrofluorimetrií v případě arylových polymerů,

kapalinovou chromatografií s hmotovým spektrometrem (LC-MS) v případě vzorků s nízkou molekulovou hmotností,

nebo vakuovým odpařením vodného extraktu do sucha a spektroskopickou (IR nebo UV atd.) nebo AAS/ICP analýzou zbytku.

Není-li analýza vodné fáze jako takové možná, měl by být vodný extrakt extrahován s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem, např. chlorovaným uhlovodíkem. Rozpouštědlo se poté odpaří a zbytek se analyzuje způsobem popsaným výše pro obsah polymeru. Jakékoliv složky, které jsou identifikovány jako nečistoty nebo přísady se odečtou, aby byl stanoven stupeň rozpustnosti samotného polymeru.

Jsou-li přítomny relativně velká množství takových materiálů, může být nezbytné analyzovat zbytek například HPLC nebo GC, aby se odlišily nečistoty od přítomného monomeru nebo derivátů monomeru a aby tak mohl být stanoven skutečný obsah monomeru nebo jeho derivátů.

V některých případech může být dostačující pouhé odpaření organického rozpouštědla do sucha á zvážení suchého zbytku.

XI. 1.5.4.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku

Všechny vodné extrakty se analyzují na celkový obsah organického uhlíku.

Provede se vážkové stanovení nerozpuštěného/neextrahovaného podílu vzorku. Zůstávají-li po odstředění nebo filtraci obsahu každé nádoby usazeny na stěnách nádoby zbytky polymeru, měla by být nádoba oplachována filtrátem, dokud není vyčištěna od všech viditelných zbytků. Poté se filtrát opět odstředí nebo zfiltruje. Zbytky, které zůstanou na filtru nebo v centrifugační kyvetě se vysuší za vakua při 40 °C a zváží. Sušení se provádí do konstantní hmotnosti.

XI.2 DATA

XI.2.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku

Po každou ze tří baněk by měly být uvedeny jednotlivé výsledky a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg/l) nebo v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost vzorku polymeru (obvykle mg/g). Kromě toho by měla být uvedena ztráta hmotnosti vzorku (vypočtená jako hmotnost rozpuštěné látky dělená hmotností výchozího vzorku). Měly by být vypočteny relativní směrodatné odchylky (RSD). Měla by být uvedena jednotlivá čísla pro celkovou látku (polymer + hlavní přísady atd.) a pro samotný polymer (tj. po odečtení příspěvku od těchto přísad).

XI.2.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku

Pro každý experiment by měly být uvedeny jednotlivé hodnoty TOC ve vodných extraktech obou trojitých experimentů a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg C/l) a rovněž v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost výchozího vzorku (obvykle mg C/g).

Není-li mezi výsledky pro vysoké a nízké poměry vzorek/voda rozdíl, může to znamenat, že všechny extrahovatelné složky byly skutečně vyextrahovány. V takovém případě nebývá přímá analýza obvykle nezbytná.

Měly by být uvedeny jednotlivé hmotnosti zbytků vyjádřené v procentech výchozích hmotností vzorků. Měly by být vypočteny průměrné hodnoty za celý experiment Rozdíly mezi 100 % a zjištěnými hodnotami v procentech představují množství rozpustného a extrahovatelného materiálu v původním vzorku vyjádřené v procentech.

XI.3 ZPRÁVY

XI.3.1 Protokol o zkoušce

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XI.3.1.1 Zkušební látka

dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty, obsah podílu o nízké molekulové hmotnosti).

XI.3.1.2 Experimentální podmínky

popis použitých postupů á experimentálních podmínek,

popis analytických a detekčních metod.

XI.3.1.3 Výsledky

výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/l; jednotlivé a střední hodnoty pro extrakční zkoušky v různých rozpouštědlech, rozepsané podle obsahu polymeru, nečistot, přísad atd.,

výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/g polymeru,

hodnoty TOC ve vodných extraktech, hmotnost rozpuštěné látky a vypočtené procentuální hodnoty (byla-li stanovena),

hodnota pH každého vzorku,

informace o hodnotách pro slepý pokus,

podle potřeby upozornění na chemickou nestabilitu zkušební látky během zkušebních postupů a analytických postupů,

všechny informace, které jsou důležité pro interpretaci výsledků.

XI.4 LITERATURA

(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

Příloha č. 2 k vyhlášce č. 222/2004 Sb.

METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ

I. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO RYBY - metoda C.1 podle přílohy směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“)

I.1. METODA

I.1.1 ÚVOD

Účelem této zkoušky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Pro usnadnění výběru nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) s cílem zajistit dostatečně konstantní koncentrace zkušební látky po celou dobu experimentu je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Akutní toxicitou se rozumí zřetelný nepříznivý účinek, který je v krátké době (řádově ve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. V této zkoušce se akutní toxicita vyjadřuje prostřednictvím střední letální koncentrace (LC50), tj. takové koncentrace látky ve vodě, která během nepřetržité expozice po určitou dobu způsobí úhyn 50 % jedinců ve zkušební skupině ryb.

Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.

I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.

Ryby se vystaví účinku různým koncentracím zkušební látky přidané do vody po dobu 96 h. Úhyn se zaznamenává nejméně každých 24 h a je-li to možné, vypočtou se při každém pozorování koncentrace, které způsobí úhyn 50 % ryb (LC50).

I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.

Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije méně než deset ryb).

Koncentrace rozpuštěného kyslíku musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 60 % hodnoty nasycení vzduchem.

Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původních hodnot koncentrací.

U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

U látek, které

i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo

ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo

iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích ryb.

Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

pH by se nemá změnit o více než 1.

I.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

Mohou být použity tři postupy:

Statická zkouška:

Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká. (Roztoky se během celé zkoušky nemění.)

Semistatická metoda:

Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká, ale je pravidelně pò delších časových úsecích (např. po 24 h) zcela vyměňován.

Průtoková metoda:

Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádržích neustále obměňuje, přičemž se zkušební látka přivádí s vodou, kterou se zkušební médium obnovuje.

I.1.6.1 Činidla

I.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.

Látky se obvykle zkouší až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní ryby. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.

Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou při a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistují specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.

I.1.6.1.2 Voda pro chov ryb a ředění

Může být použita pitná voda (nekontaminovaná potenciálně škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní voda nebo upravená voda (viz doplněk 1). Upřednostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg·l-1 (vztaženo na CaCO3) a pH od 6,0 do 8,5.

I.1.6.2 Přístroje

Veškeré přístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu:

systém pro automatické ředění (pro průtokovou metodu),

přístroj pro měření koncentrace kyslíku,

vybavení pro stanovení tvrdosti vody,

vhodný přístroj pro měření teploty,

pH-metr.

I.1.6.3 Testovací ryby

Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.

Použitý druh by měl být zvolen podle praktických kritérií, jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli další významné ekonomické a biologické faktory. Při výběru druhu ryb by měla být také zohledněna potřeba srovnatelnosti získaných dat a mezinárodní harmonizace (1).

Seznam doporučených druhů ryb pro provedení této zkoušky je uveden v doplňku 2; dává se přednost druhům danio pruhované a pstruh duhový.

I.1.6.3.1 Chov

Ryby by měly pocházet pokud možno z jednoho chovu a měly by být stejné délky a stejného stáří. Ryby musí být chovány nejméně 12 dní v následujících podmínkách:

Obsádka:

Vhodná vzhledem k metodě (metoda s recirkulací nebo průtoková metoda) a druhu ryb.

Voda:

Viz 1.6.1.2.

Osvětlení:

Osvětlení 12 až 16 h denně.

Koncentrace rozpuštěného kyslíku:

Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.

Krmení:

Třikrát týdně nebo jednou za den; vysazení krmení 24 h před začátkem zkoušky.

I.1.6.3.2 Mortalita

Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:

mortalita vyšší než 10 % populace za 7 dní: celá obsádka ryb se vyřadí,

mortalita 5 až 10 % populace: v chovu se pokračuje dalších 7 dní. Nedojde-li k dalším případům úhynu, obsádka se použije, v opačném případě musí být vyřazena,

mortalita menší než 5 % populace: obsádka je pro zkoušku použitelná.

I.1.6.4 Aklimatizace

Všechny ryby musí být nejméně na 7 dnů před použitím ve zkoušce nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použije při zkoušce.

I.1.6.5 Zkušební postup

Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.

Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.

V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkušební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouška, aby byla splněna kritéria jakosti.

Ryby se exponují zkušební látce za níže uvedených podmínek:

délka expozice: 96 h;

počet ryb: nejméně 7 na každou koncentraci;

nádrže: vhodný objem vzhledem k doporučené obsádce;

obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporučuje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je přijatelná vyšší obsádka;

zkušební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %;

voda: viz 1.6.1.2;

osvětlení: osvětlení 12 až 16 h denně;

teplota: podle druhu ryb (doplněk 2), avšak v rámci dané zkoušky kolísající v toleranci ±1 °C;

koncentrace rozpuštěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě;

krmení: žádné.

Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 h a dále nejméně každých 24 h. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrně žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.

Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).

Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty se provádí denně.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.

Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným počtem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je při použití 10 ryb a při nulové mortalitě 99,9% pravděpodobnost, že je LC50 větší než 100 mg·l-1. Při 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně 99% pravděpodobnost, že je LC50 větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.)

Dojde-li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky, zaznamenají se.

I.2 DATA A HODNOCENÍ

Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24, 48, 72 a 96 h), vynese pro každou expoziční dobu mortalita v procentech proti koncentraci.

Pokud je to možné, odhadnou se standardními postupy pro každou délku expozice hodnoty LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).

V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty LC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.

Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají mortalitu 0 a 100 %, jsou dostatečnou informací o tom, že se LC50 nachází mezi těmito hodnotami.

Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

I.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

údaje o testovacích rybách (vědecký název, kmen, dodavatel, veškerá předchozí ošetření, velikost a počet ryb použitých při každé zkušební koncentraci);

zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, tvrdost, teplota);

u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;

koncentrace všech pomocných látek;

přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;

jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;

výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;

důvody pro volbu použitého zkušebního postupu a podrobnosti o něm (např. statický, semistatický, dávkování, průtoková rychlost, zda byla voda provzdušňována obsádka ryb atd.);

popis zkušebního zařízení;

světelný režim;

koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků každých 24 h;

důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;

tabulka kumulativních hodnot mortality při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování;

graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;

podle možnosti hodnoty LC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti);

použité statistické metody stanovení hodnot LC50;

při použití referenční látky a údaj o získaných výsledcích;

nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky úhyn ryb;

nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100 % mortalitu.

I.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods -NFT 90-303, June 1985.

(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow-Through methods -NFT 90-305, June 1985.

(4) ISO 7346/1, /2, /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden -Part II 1974.

(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L(15):

(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th ed., APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm, Exp. Therap., 1949, 96, 99.

(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.

(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.

(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.


DODATEK 1

Upravená voda

Příklad vhodné ředicí vody

Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm-1.

Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Zásobní roztoky:

CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.11,76 g
MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.4,93 g
NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.2,59 g
KCl (chlorid draselný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.0,23 g

Upravená ředicí voda

Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.

Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

pH musí být 7,8 ± 0,2.

Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).

Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nesmí být dále provzdušňována.

Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l-1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l-1.

Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.


DODATEK 2

Druhy ryb doporučené pro zkoušení

Doporučený druhDoporučený rozsah
teplot při zkoušce
(°C)
Doporučená
celková délka ryb
(cm)
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)
(Hamilton - Buchanan), danio pruhované
20 až 243,0 ± 0,5
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
(Rafinesque), střevle
20 až 245,0 ± 2,0
Cyprinus carpio (Teleostei Cyprinidae)
(Linneanus 1758), kapr obecný
2.0 až 246,0 ± 2,0
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
(Tomminck a Schlegel 1850), halančík japonský
20 až 243,0 ± 1,0
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)
(Peters 1859), živorodka duhová
20 až 243,0 ± 1,0
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
(Rafinesque, Linneanus 1758), slunečnice modrá
20 až 245,0 ± 2,0
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)
(Walbaum 1988), pstruh duhový
12 až 176,0 ± 2,0
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)
(Linneanus 1758), jelec jesen
20 až 246,0 ± 2,0

Opatřování ryb

Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dobře dostupné po celý rok. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.


DODATEK 3

Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci

Příklad stanovení LC50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru

Příklad stanovení LC50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru

II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE -metoda C.2 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

II.1 METODA

II.1.1 úvod

Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci látky pro imobilizaci (EC50) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před započetím zkoušky je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Požadavek směrnice stanovit LC50 pro dafnie se považuje za splněný stanovením EC50, jak je popsáno v této zkušební metodě.

Akutní toxicita se v této zkoušce vyjadřuje střední účinnou koncentrací látky pro imobilizaci (EC50) dafnií. Je to koncentrace (rozumí se výchozí koncentrace), která během nepřetržité expozice po určitou stanovenou dobu imobilizuje 50 % dafnií ve zkušební skupině během doby působení (doby expozice).

Imobilizace:

Dafnie, které nejsou schopné do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádrží začít plavat, se považují za imobilizované.

Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím čtyř různých látek je uveden v doplňku 2.

II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Dafnie se 48 h exponují zkušební látce přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se kratší doba, zdůvodní se ve zprávě.

Za jinak stejných experimentálních podmínek a v přiměřeném rozmezí koncentrací zkušební látky působí různé koncentrace zkušební látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Různé koncentrace mají za následek skutečnost, že na konci zkoušky ztrácí různý procentuální podíl dafnií schopnost plavat. Koncentrace, které nezpůsobují žádnou imobilizaci nebo způsobují 100% imobilizaci, se zjistí přímo pozorováním, zatímco hodnota 48hodinová EC50 se stanoví podle možnosti výpočtem.

Při této metodě se používá statický systém, zkušební roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

II.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI

Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.

Imobilizace v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %.

Dafnie se v kontrolních zkouškách nesmí trvale zdržovat u hladiny.

Koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušební nádrži musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 3 mg·l-1. Koncentrace kyslíku však nesmí v žádném případě klesnout pod 2 mg·l-1.

Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.

U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

U látek, které

i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo

ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo

iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích organismů.

Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

pH by se nemělo změnit o více než 1.

II.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

II.1.6.1 Činidla

II.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.

Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní dafnie. Koncentrace pomocných látek by měly být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg/l zkušebního média.

Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají ve zprávě.

II.1.6.1.2 Zkušební voda

Pro tuto zkoušku se použije upravená voda (viz doplněk 1 a odkaz (2): ISO 6341).

Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie před zkouškou, doporučuje se, aby byla voda pro kultivaci podobné jakosti (pH, tvrdost), jako voda pro zkoušku.

II.1.6.2 Přístroje

Použijí se běžné laboratorní přístroje a zařízení. Zařízení, které přijde do styku se zkušebními roztoky, by mělo být nejlépe skleněné:

přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),

vhodný přístroj pro měření teploty,

pH-metr,

vybavení pro stanovení tvrdosti vody.

II.1.6.3 Testovací organismy

Přednost se dává druhu Daphnia magna, ačkoliv se připouští také druh Daphnia pulex. Testovací dafnie musí být na začátku zkoušky mladší než 24 h, musí být laboratorně odchované, bez zjevných nemocí a musí být známého původu (např. chov, předchozí ošetření, atd.).

II.1.6.4 Zkušební postup

Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.

Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.

Dafnie se exponují zkušební látce následujícím způsobem:

délka expozice: 48 h,

počet dafnií: nejméně 20 na každou zkušební koncentraci, nejlépe rozdělených na čtyři skupiny po pěti dafniích nebo na dvě skupiny po 10 dafniích,

obsádka: na každou dafnii by měly připadat 2 ml zkušebního roztoku,

zkušební koncentrace: zkušební roztok se připraví bezprostředně před nasazením dafnií, nejlépe bez použití jiného rozpouštědla než vody. Připraví se koncentrace tvořící geometrickou řadu, přičemž poměr mezi koncentracemi nesmí být vyšší než 2,2. Zároveň s kontrolami se zkoušejí koncentrace dostatečné pro to, aby po 48 h vyvolaly nulovou nebo a 100% imobilizaci, a dále mezilehlé koncentrace umožňující výpočet 48hodinové EC50,

voda: viz 1.6.1.2,

osvětlení: střídání světla a tmy je libovolné,

teplota: zkušební teplota by měla být 18 až 22 °C, avšak v rámci dané zkoušky kolísající v tomto rozmezí maximálně o ±1 °C,

provzdušňování: zkušební roztok nesmí být provzdušňován probubláváním,

krmení: žádné.

Měření pH a obsahu rozpuštěného kyslíku v kontrolních skupinách a u všech zkušebních koncentrací se provede na konci zkoušky; pH zkušebního roztoku nesmí být měněno.

Těkavé sloučeniny se zkoušejí v hermeticky uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby nedošlo k nedostatku kyslíku.

Prohlídka dafnií se provede nejpozději po 24 h a znovu po 48 h.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

Limitní zkouška se provede s 20 dafniemi rozdělenými do dvou nebo čtyř skupin a se stejným počtem v kontrolní skupině (v kontrolních skupinách). Dojde-li k imobilizaci, musí se provést celá studie.

II.2 DATA A HODNOCENÍ

Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24 a 48 h), vynese mortalita v procentech proti koncentraci.

Pokud je to možné, odhadnou se pro každé pozorovací období EC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).

V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty EC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.

Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají nulovou a 100% imobilizaci, jsou dostatečnou informací o rozpětí, ve kterém EC50 leží.

Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

II.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

údaje o testovacím organismu (vědecký název, kmen, dodavatel nebo původ, veškerá předchozí ošetření, metoda chovu - včetně původu, druhu a množství potravy, frekvence krmení);

zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, teplota, tvrdost);

u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;

koncentrace všech pomocných látek;

přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;

jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;

výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;

popis zkušebního zařízení;

světelný režim;

koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků;

důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;

tabulka kumulativních hodnot imobility při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování (24 a 48 h);

graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;

podle možnosti hodnoty EC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti)

použité statistické metody stanovení hodnot EC50;

při použití referenční látky údaj o získaných výsledcích;

nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky imobilizaci;

nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100% imobilizaci.

II.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - Crustacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).

(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

(7) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 1949, 96, 99-113.

(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.

(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.

(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.


DODATEK 1

Upravená voda

Příklad vhodné ředicí vody (podle ISO 6341)

Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm-1.

Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Zásobní roztoky:

CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
11,76 g
MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
4,93 g
NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
2,59 g
KCl (chlorid draselný)
se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
0,23 g

Upravená ředicí voda

Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.

Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

pH musí být 7,8 ± 0,2.

Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).

Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nemusí být dále provzdušňována.

Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l-1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l-1.

Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.


DODATEK 2

Souhrn výsledků kruhového testu EHS provedeného v roce 1978 (citovaného také v (2)).

Upozornění: účelem tohoto kruhového testu bylo stanovení 24hodinové hodnoty EC50.

Použité látky:

1) Dichroman draselný

2) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová

3) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl

4) Kyselina 2,4,5-trichlorfenoxyoctová, draselná sůl

LátkaPočet zúčastněných
laboratoří
Počet výsledků pro
výpočet
Střední hodnota
24hodinové EC50
mg/l
1461291,5
23610827
3318427
43272770

DODATEK 3

Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci

Příklad stanovení EC50 s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru

Příklad stanovení EC50 s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru

III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS - metoda C.3 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

III.1 METODA

III.1.1 ÚVOD

Účelem této zkoušky je stanovit účinky látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobými zkouškami (72 h) lze posoudit účinky na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití s několika druhy řas, přičemž musí být v protokolu o zkoušce uveden popis metody.

Použití metody je nejsnadnější v případě látek rozpustných ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně zůstávají ve vodě.

Metodu lze použít pro látky, které přímo neovlivňují měření růstu řas.

Je žádoucí mít před započetím zkoušky k dispozici co nejúplnější údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Hustota buněk: počet buněk na jeden mililitr.

Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.

Růstová rychlost: nárůst hustoty buněk za jednotku času.

EC50: v této metodě jde o koncentraci zkušební látky, která má za následek 50% snížení růstu (EbC50) nebo růstové rychlosti (ErC50) vzhledem ke kontrole.

NOEC (no observed effect concentration): v této metodě jde o je nejvyšší zkoušenou koncentraci, při níž není pozorováno žádné významné snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.

Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

Při použití referenční látky musí být výsledky uvedeny do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření, pokud se použijí. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních testech (viz (3) a doplněk 2).

III.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Exponenciálně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou po několik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkušební látky.

Zkušební roztoky se kultivují 72 h, během nichž se alespoň každých 24 h měří hustota buněk v každém roztoku. Stanoví se snížení růstu ve srovnání s kontrolní kulturou.

III.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI

Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na celý zkušební postup.

Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla za 3 dny zvýšit alespoň šestnáctkrát.

Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.

U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

U látek, které

i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo

ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo

iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,

musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení.

Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

Je známo, že podstatná část zkušební látky může být během zkoušky zabudována do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií jakosti mělo brát v úvahu jak množství látky zabudované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, může být dodržení kritérií jakosti prokázáno zkouškou s nejvyšší koncentrací látky, ale bez řas, a měřením koncentrací v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky,

III.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU

III.1.6.1 Činidla

III.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

Zvolené zkušební koncentrace se připraví přidáním vhodného alikvotního podílu k předkulturám řas (viz doplněk 1).

Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontroly. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na 1 zkušebního média.

Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.

III.1.6.1.2 Zkušební médium

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm-1. Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Je doporučeno následující médium:

Podle následující tabulky se připraví čtyři zásobní roztoky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo v autoklávu a skladují se v temnu při 4 °C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.

ŽivinaKoncentrace
v zásobním roztoku
Konečná koncentrace
ve zkušebním roztoku
Zásobní roztok č. 1: makroživiny
NH4Cl1,515 mg·l-1
MgCl2·6H2O1,212 mg·l-1
CaCl2·2H2O1,818 mg·l-1
MgSO4·7H2O1,515 mg·l-1
KH2PO40,161,6 mg·l-1
Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA
FeCl3·6H2O800,08 mg·l-1
Na2EDTA·2H2O1000,1 mg·l-1
Zásobní roztok č. 3: stopové prvky
H3BO31850,18 mg·l-1
MnCl2·4H2O4150,415 mg·l-1
ZnCl233x10-3 mg·l-1
CoCl2·6H2O1,51,5x10-3 mg·l-1
CuCl2·2H2O0,011x10-5 mg·l-1
Na2MoO4·2H2O77x10-3 mg·l-1
Zásobní roztok č. 4: NaHCO3
NaHCO35050 mg·l-1

Po ustálení a po provzdušnění by mělo mít médium hodnotu pH přibližně 8.

III.1.6.2 Přístroje a pomůcky

Běžné laboratorní vybavení.

Kultivační baňky o vhodném objemu (např. Erlenmeyerovy baňky na 250 ml jsou vhodné v případě zkušebního roztoku o objemu 100 ml). Všechny zkušební baňky by měly být identické, pokud jde o materiál a rozměry.

Kultivační zařízení: místnost nebo komora, v nichž lze udržovat teplotu 21 - 25 °C ± 2 °C a stálé rovnoměrné osvětlení v rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliže všechny řasy v kontrolních kulturách dosáhly doporučené růstové rychlosti, lze předpokládat, že podmínky pro jejich růst, včetně intenzity světla, jsou vyhovující.

U zkušebních roztoků s průměrnými koncentracemi se doporučuje použít světelnou intenzitu od 60 do 120 μE·m-2·s-1 (35 - 70·1018 fotonů m-2·s-1) při měření v rozsahu 400 - 700 nm vhodným detektorem. Při měření intenzity luxmetry je přijatelný rozsah odpovídající 6000 - 10 000 1x.

Této světelné intenzity lze dosáhnout umístěním čtyř až sedmi univerzálních bílých 30W zářivek (teplota chromatičnosti přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.

Měření hustoty buněk by se mělo provádět přímým počítáním živých buněk, např. pod mikroskopem s počítacími komůrkami. Za předpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie,...).

III.1.6.3 Testovací organismy

Je doporučeno použít rychle rostoucí druhy zelených řas vhodné pro kultivaci a zkoušení. Dává se přednost následujícím druhům:

Selenastrum capricornutum, např. ATCC 22662 nebo CCAP 278/4,

Scenedesmus subspicatus, např. 86.81 SAG.

Poznámka:

ATCC = American Type Culture Collection (USA)

CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (VB)

SAG = Collection of algal culture (Göttingen, SRN)

Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.

III.1.6.4 Zkušební postup

Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, se určí na základě výsledků orientačních zkoušek.

Dva parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost), mohou poskytovat zcela rozdílné hodnoty snížení růstu; v orientační zkoušce by měly být použity oba parametry, aby mohlo zajištěno, že geometrická řada koncentrací umožní odhadnout jak EbC50, tak ErC50.

Počáteční hustota buněk

Doporučuje se, aby byla počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích přibližně 104 buněk na ml. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být biomasa srovnatelná.

Koncentrace zkušební látky

Pro zkoušku se připraví geometrická řada nejméně pěti koncentrací lišících se od sebe vždy faktorem nepřekračujícím 2,2. Nejnižší zkoušená koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe by měla růst zcela zastavit.

Opakování a kontroly

Plán zkoušky by měl zahrnovat tři opakování s každou zkušební koncentrací. Dále se provedou tři kontroly bez zkušební látky, a je-li použita pomocná látka, též tři kontroly s touto látkou. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky s každou koncentrací.

Provedení zkoušky

Zkušební roztoky o požadované koncentraci zkušební látky a požadovaném množství inokula řas se připraví přidáním alikvotních podílů zásobního roztoku zkušební látky k vhodnému množství prekultury řas (viz doplněk 1).

Kultivační baňky se protřepou a umístí se do kultivačního zařízení. Buňky řas se udržují v suspensi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, aby se zlepšila výměna plynů a zmenšilo se kolísání pH ve zkušebních roztocích. Kultury se udržují při teplotě 21 - 25 °C udržované s přesností na ± 2 °C.

Hustota, buněk v každé baňce se stanoví nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se měření hustoty buněk jiná metoda, než je jejich přímé počítání, použije se ke stanovení pozadí filtrované médium pro kultivaci řas obsahující odpovídající koncentraci zkušební chemické látky.

pH se měří na začátku zkoušky a po 72 h.

Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc než o 1,5.

Zkoušení těkavých látek

V současné době neexistuje obecně přijatý způsob zkoušení těkavých látek. Je-li o látce známo, že se snadno vypařuje, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným mrtvým objemem. Při plánování objemu horní části kultivačních baněk se musí zohlednit eventuální nedostatek CO2. Byly navrženy varianty této metody (4).

Měl by být učiněn pokus stanovit množství zkušební látky, které v roztoku zůstalo; při interpretaci výsledků zkoušek s těkavými látkami v uzavřených systémech je doporučeno postupovat mimořádně opatrně.

Limitní zkouška

S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

Je-li povaha zkušební látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

Limitní zkouška se provede alespoň třikrát, se stejným počtem kontrol.

V limitní zkoušce se stanoví oba parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost).

Zjistí-li se v limitní zkoušce pokles růstu biomasy nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolami o 25 % nebo více, provede se úplná zkouška.

III.2 DATA A HODNOCENÍ

Naměřené hustoty buněk ve zkušební kultuře a v kontrolách se spolu s koncentracemi zkušební látky a dobami měření shrnou do tabulky. Střední hodnota hustoty buněk pro každou zkušební koncentraci a pro kontroly se vynese proti času (0 - 72 h) a sestrojí se růstová křivka.

Vztah koncentrace/účinek se stanoví dvěma následujícími postupy. Některé látky mohou růst při nízkých koncentracích stimulovat. V úvahu by měla být vzata pouze data udávající potlačení růstu mezi 0 a 100 %.

III.2.1 POROVNÁNÍ PLOCH POD RŮSTOVÝMI KŘIVKAMI

Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou linií N = N0 se vypočte podle následujícího vzorce:

N1 − N2 N1 + N2 − 2N0 Nn−1 + Nn − 2N0
A = ———— · t1 + —————— · (t2 − t1) + ... + ——————— · (tn − tn−1)
2 2 2

kde

A = plocha,

N0 = počet buněk v ml v čase t0 (na počátku zkoušky),

N1 = naměřený počet buněk v 1 ml v čase t1,

Nn = naměřený počet buněk v 1 ml v čase tn,

t1 = doba prvního měření od počátku zkoušky,

tn = doba n-tého měření od počátku zkoušky,

n = počet měření od počátku zkoušky.

Potlačení růstu vyjádřené v % (IA) se pro každou koncentraci zkušební látky vypočte podle vzorce:

Ac − At
IA = ———— × 100
Ac

kde

Ac = plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N0,

At = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N0.

Hodnoty IA se nanesou na semilogaritmický nebo na pravděpodobnostní semilogaritmický papír proti odpovídajícím koncentracím. Vynesou-li se body na pravděpodobnostní papír, proloží se body přímka, a to ručně nebo regresním výpočtem.

Hodnota EC50 se odhadne odečtením z regresní přímky jako koncentrace odpovídající 50% snížení růstu (IA = 50 %). Pro jednoznačné označení této hodnoty v rámci této metody výpočtu se doporučuje použít symbol EbC50. Je důležité, aby byla s hodnotou EbC50 uvedena příslušná expoziční doba, např. EbC50 (0 − 72 h).

III.2.2 POROVNÁNÍ RŮSTOVÝCH RYCHLOSTÍ

Průměrnou specifickou růstovou rychlost (μ) pro exponenciálně rostoucí kultury lze vypočítat jako:

lnNn − lnN0
μ = —————
tn − t0

kde t0 je čas začátku zkoušky.

Průměrnou specifickou růstovou rychlost lze také odvodit ze sklonu regresní přímky v závislosti ln N na čase.

Snížení specifické růstové rychlosti vyjádřené v procentech pro každou koncentraci zkušební látky (Iμt) se vypočte podle vzorce:

μc − μt
Iμt = ——— x 100
μc

kde

μc = střední specifická růstová rychlost v kontrole,

μt = střední specifická růstová rychlost pro zkušební koncentraci i.

Snížení střední specifické růstové rychlosti v procentech při všech koncentracích zkušební látky ve srovnání s kontrolní hodnotou se vynese proti logaritmu koncentrace. Hodnotu EC50 lze odečíst z výsledného grafu. Pro jednoznačné označení EC50 odvozené touto metodou se doporučuje použít symbol ErC50. Musí být uvedeny okamžiky měření, např. vztahuje-li se hodnota k času 0 a k 72 h, označí se symbolem ErC50 (0 -72 h):

Poznámka: Ve výrazu pro specifickou růstovou rychlost vystupují logaritmy, tzn. malé změny růstové rychlosti mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty EbC a ErC tedy nejsou číselně srovnatelné.

III.2.3 VÝPOČET NOEC

Hodnota koncentrace nezpůsobující žádné pozorovatelné účinky (NOEC) se stanoví vhodnou statistickou metodou pro srovnávání více vzorků (např. analýza rozptylu a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch pod růstovými křivkami A (viz bod 2.1) nebo specifických růstových rychlostí μ (viz bod 2.2).

III.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

zkušební látka: údaje o chemické identitě;

testovací organismus: původ, laboratorní kultura, číslo kmene, metoda kultivace;

zkušební podmínky:

datum zahájení a ukončení zkoušky a délka zkoušení,

teplota,

složení média,

kultivační zařízení,

hodnoty pH roztoku na počátku a na konci zkoušky (je-li pozorováno kolísání pH o více než 1,5, uvede se vysvětlení),

nosič a metoda použitá pro rozpouštění zkušební látky, koncentrace nosiče ve zkušebních roztocích,

intenzita a kvalita světla,

zkoušené koncentrace (naměřené nebo nominální);

výsledky:

koncentrace buněk v jednotlivých baňkách v každé době měření a metoda měření koncentrace buněk,

průměrné hodnoty koncentrace buněk,

růstové křivky,

grafické znázornění vztahu koncentrace - účinek,

hodnoty EC a metoda výpočtu,

NOEC,

další pozorované účinky.

III.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus“, In: Rudolph / Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986.

(3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4) S. Galassi, M. Vighi. Chemosphere, 1981, 10, 1123-1126.


DODATEK 1

Příklad postupu kultivace řas

Obecné poznámky

Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxicity.

Měly by být použity vhodné metody k tomu, aby bylo zajištěno, že kultury řas nebudou infikovány bakteriemi (ISO 4833). Vhodné mohou být axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.

Všechny operace se provádějí za sterilních podmínek, aby nedošlo ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami. Kontaminované kultury se vyřadí.

Postupy při získání kultur řas

Příprava živných roztoků (média):

Médium lze připravit zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace v autoklávu může vést ke ztrátě NH3.

Kmenová kultura:

Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravidelně přenášejí do čerstvého média, kde slouží jako výchozí testovací materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar. Poté se nejméně jednou za dva měsíce přenášejí do čerstvého média.

Kmenové kultury se pěstují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné medium (objem přibližně 100 ml). Jsou-li řasy kultivovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.

Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby byla výchozí koncentrace u rychle rostoucího druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.

Růstovou rychlost druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Je-li známa, lze z ní odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.

Předkultura:

Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování testovacích kultur. Předkultura se kultivuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit.


DODATEK 2

V normě ISO 8692 - Jakost vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum jsou uvedeny výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

Střední hodnota (mg·l-1)Rozpětí (mg·l-1)
ErC50 (0 - 72 h)0,840,60 až 1,03
EbC50 (0 - 72 h)0,530,20 až 0,75

IV. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI - metody C.4 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IV.I.l ÚVOD

Je popsáno šest metod, které umožňují screeningové posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:

a) Zkouška na úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC) (metoda C.4-A)

b) Modifikovaná screeningová zkouška OECD - na úbytek DOC (metoda C.4-B)

c) Zkouška na uvolňování oxidu uhličitého (CO2) (modifikovaná Sturmova zkouška) (metoda C.4-C)

d) Zkouška manometrickou respirometrií (metoda C.4-D)

e) Zkouška v uzavřených lahvičkách (metoda C.4-E)

f) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu -Japonsko) (metoda C.4-F)

Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a návody.

Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru látky, která má být zkoušena, se však může dávat přednost určité metodě.

IV.I.2 VÝBĚR VHODNÉ METODY

Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, tenzi par a o adsorpčních vlastnostech chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO2, DOC, TOC, CHSK (viz přílohy I a II) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.

Zkušební chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě je alespoň 100 mg·l-1, lze zkoušet všemi metodami za předpokladu, že netěkají a neadsorbují se. Pro látky špatně rozpustné ve vodě, které těkají nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Způsob, jakým je třeba zacházet s látkami špatně rozpustnými ve vodě a s látkami těkavými, je popsán v příloze III. Mírně těkavé látky je možno zkoušet metodou úbytku DOC, pokud je ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro zohlednění případné fyzikální ztráty.

Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

ZkouškaAnalytická metodaVhodnost pro látky
špatně r
ozpustné
těkavéadsorbující
se
na úbytek DOCrozpuštěný organický uhlík+ /−
modif. zkouška OECD
- na úbytek DOC
rozpuštěný organický uhlík+ /−
na uvolňování CO2respirometrie: uvolňování CO2++
manometrická respirometriemanometrická respirometrie: spotřeba kyslíku++ /−+
zkouška v uzavřených lahvičkáchrespirometrie: rozpuštěný kyslík+ /−++
MITIrespirometrie: spotřeba kyslíku++/−+

Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkušebního materiálu.

Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkušební chemické látky pro bakterie (příloha IV); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.

IV.I.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Pro ověření postupu se souběžně se zkouškou a ve vlastní baňce zkoušejí referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.

Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), natrium-acetát, natrium-benzoát. Všechny tyto referenční chemické látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.

Byl podán návrh hledat referenční chemickou látku, která by byla snadno rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Navržen byl kalium-hydrogen-ftalát. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.

V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).

IV.I.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD

Roztok nebo suspense zkušební látky v minerálním prostředí se inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním světle. Množství DOC ve zkušebním roztoku pocházející z inokula se musí udržovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze zkušební látky co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě souběžné slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky, třebaže endogenní aktivita buněk v přítomnosti látky přesně neodpovídá aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se souběžně provádí zkouška s referenční látkou.

Obecně se rozklad sleduje stanovením parametrů jako DOC, tvorba CO2 nebo spotřeba kyslíku a měření se provádějí v dostatečně krátkých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se doplňkově k jinému parametru měří DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Lze rovněž použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkušební látky nebo kterou se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).

Zkouška obvykle trvá 28 dnů. Je však možné ukončit měření před uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje křivka biologického rozkladu plató po tři po sobě následující měření. Je také možné měření po 28 dnech prodloužit, jestliže z křivky vyplývá, že biologický rozklad začal, avšak 28. dne ještě nebylo ještě dosaženo plató.

IV.I.5 KRITÉRIA JAKOSTI

IV.I.5.1 Reprodukovatelnost

Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula se stanovení provádějí nejméně duplicitně.

Je obecně známo, že čím vyšší je koncentrace mikroorganismů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi vícenásobnými měřeními. Okružní testy rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.

IV.I.5.2 Platnost zkoušky

Zkouška se považuje za platnou, je-li na konci zkoušky nebo popřípadě na konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních výsledků vícenásobných měření rozkladu zkušební chemické látky v oblasti plató křivky menší než 20 % a dosáhl-li stupeň rozkladu referenční látky vyjádřený v procentech úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, měření se opakuje. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně skutečnost, že zkušební látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale znamenají, že k prokázání biologické rozložitelnosti jsou třeba další studie.

Jestliže ve zkoušce toxicity zahrnující jak zkušební látku, tak referenční chemickou látku došlo během 14 dnů k méně než 35% rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k méně než 25% rozkladu (stanoveného podle TSK nebo TCO2), lze zkušební chemické látky považovat za inhibující (viz také příloha IV). Série zkoušek by měla být opakována, pokud možno s nižší koncentrací zkušební chemické látky a/nebo s vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.

IV.I.6 OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA

Obecné podmínky pro zkoušky jsou shrnuty v tabulce 2. Přístroje a další experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

Tabulka 2: Zkušební podmínky

ZkouškaZkouška na
úbytek DOC
Zkouška na
uvolňování CO2
Manometrická
respirometrie
Modif. screeningová
zkouška OECD
Zkouška v uzavřených
lahvičkách
Zkouška MITI (I)
Koncentrace zkušební látky
mg·l-11002 - 10100
mg DOG/110-4010 - 2010 - 40
mg TSK/l50 - 1005 - 10
Koncentrace inokula (buňky/l,
přibližně)
≤ 30 mg/l SL nebo ≤ 100 ml odpadní vody/l
(107-108)
0,5 ml sekundární odpadní vody/l
(105)
≤ 5 ml odpadní vody/l
(104-106)
30 mg/l SL
(107-108)
Koncentrace prvků
v minerálním médiu (v mg·l-1)
P11611,629
N1,30,131,3
Na868,617,2
K12212,236,5
Mg2,22,26,6
Ca9,99,929,7
Fe0,05 - 0,10,05 - 0,10,15
pH7,4 ± 0,2nejlépe 7,0
Teplota22 ± 2 °C25 ± 1 °C
DOC = rozpuštěný organický uhlík, TSK = teoretická spotřeba kyslíku, SL = suspendované látky

IV.I.6.1 Ředicí voda

Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek (např. ionty Cu2+). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkušebním materiálem. Vysoká čistota vody pro zkoušky je nezbytná pro to, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontaminace může pocházet z vlastních přítomných nečistot, z materiálu měniče iontů, z rozkladných látek z bakterií a řas. Pro každou sérii měření se použije pouze jedna šarže vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.

IV.I.6.2 Zásobní roztoky minerálních složek

Pro přípravu zkušebních roztoků se připraví zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu OECD, metodu s uvolňováním CO2, pro manometrickou respirometrii a pro metodu s uzavřenými lahvičkami.

Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkoušky.

Zásobní roztoky:

Za použití reakčních činidel čistoty p.a. se připraví následující zásobní roztoky:

a)

Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO48,50 g
Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO421,75 g
Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát, Na2HPO4·2H2O33,40 g
Chlorid amonný, NH4Cl0,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.

b)

Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl227,50 g
nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl2·2H2O36,40 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

c)

Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O22,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

d)

Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O0,25 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.

IV.I.6.3 Zásobní roztoky chemických látek

Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g·l-1, rozpustí se například 1 - 10 g (podle potřeby) zkušební nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky připravují v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud jde o postup s méně rozpustnými chemickými látkami, viz příloha III; ve zkoušce MITI (metoda C.4-F) se nepoužívají ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.

IV.I.6.4 Inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce na úbytek DOC, na uvolňování CO2 a ve zkoušce manometrickou respirometrií, měl by být odebrán z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované screeningové zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je potřebné zředěnější inokulum bez vloček kalu a nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v oddílu věnovaném této zkoušce.

IV.I.6.4.1 Inokulum z aktivovaných kalů

Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Podle potřeby se filtrací přes jemné síto odstraní hrubé částice a kal se udržuje v aerobních podmínkách.

Jinou možností je usazení nebo odstředění (např. 10 min při 1 100 g) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 - 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a až do použití se provzdušňuje.

Kal by měl být odebrán z dobře fungující konvenční čistírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo předpokládá-li se, že kal obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstředí, voda nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.

Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsně před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných tuhých látek.

Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3 - 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 min zpracovává v mechanickém mísiči při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 min, popřípadě déle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml na litr minerálního média.

IV.I.6.4.2 Jiné zdroje inokula

Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 h usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a dekantovaná kapalina nebo filtrát se až do použití udržuje v aerobních podmínkách. Na litr média lze použít až 100 ml tohoto typu inokula.

Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní vody, a uchovává se až do použití v aerobních podmínkách. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odstředěním.

IV.I.6.5 Předběžná úprava inokulí

Inokula je možné předběžně upravit pro experimentální podmínky, ale nikoli předběžně adaptovat na zkušební látku. Předběžná úprava spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 - 7 dnů při zkušební teplotě. Předběžná úprava někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžná úprava inokula pro zkoušku MITI se nepovažuje za nutnou.

IV.I.6.6 Abiotické kontroly

V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkušební látky stanovením úbytku DOC, přijmu kyslíku nebo uvolňování oxidu uhličitého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací přes membránu (0,2 - 0,45 μm) nebo přidáním vhodné toxické látky v odpovídající koncentraci. Používá-li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkušební látky, měly by zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována.

IV.I.6.7 Počet nasazených baněk

Počet nasazených baněk v typické zkoušce je uveden v oddílech věnovaných jednotlivým zkouškám.

Mohou být použity tyto baňky:

Zkušební suspense: obsahující zkušební látku a inokulum

Slepá zkouška s inokulem: obsahující pouze inokulum

Kontrolní zkouška postupu: obsahující referenční látku a inokulum

Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkušební látku (viz I.6.6)

Kontrola adsorpce: obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo

Kontrola toxicity: obsahující zkušební látku, referenční látku a inokulum

Stanovení ve zkušební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být prováděny souběžně. Doporučuje se, aby stanovení v ostatních baňkách bylo prováděno rovněž souběžně.

To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo aby se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období rozkladu.

IV.I.7 DATA A HODNOCENÍ

Při výpočtu rozkladu v procentech Dt, se použijí střední hodnoty z měření parametru provedených duplicitně v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu s inokulem. Vzorce jsou uvedeny dále v oddílech pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a vyznačí se 10denní období rozkladu. Vypočte se a uvede úbytek v procentech dosažený na konci 10denního období rozkladu a hodnota pro plató křivky nebo popřípadě hodnota odpovídající konci zkoušky.

V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).

IV.I.7.1 Měření rozkladu prostřednictvím stanovení DOC

Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) by se měla hodnota rozkladu Dt v procentech v každém časovém okamžiku, ve kterém se odebral vzorek, vypočítat odděleně pro každou baňku obsahující zkušební látku, a to pomocí středních hodnot měření DOC provedených duplicitně. Vypočte se podle následující rovnice:

Ct − Cbt
Dt = ( 1 − ————) × 100
C0 − Cb0

kde

Dt = rozklad v procentech v čase t,

C0 = střední počáteční koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku (v mg DOC na litr),

Ct = střední koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku v čase t (v mg DOC na litr),

Cbo = střední počáteční koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu (v mg DOC na litr),

Cbt = střední koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu v čase t (v mg DOC na litr).

Všechny koncentrace se stanoví experimentálně.

IV.I.7.2 Rozklad měřený specifickou analýzou

Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypočte se primární biologický rozklad z rovnice:

Sb − Sa
Dt = ——— × 100
Sb

kde

Dt = rozklad v procentech v čase t, obvykle po 28 dnech,

Sa = zbylé množství zkušební látky v médiu s inokulem na konci zkoušky (mg),

Sb = zbylé množství zkušební látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla přidána pouze zkušební látka (mg).

IV.I.7.3 Abiotický rozklad

Použije-li se abiotická sterilní kontrola, vypočte se abiotický rozklad v procentech podle rovnice:

Cs(0) − Cs(t)
abiotický rozklad v % = ————— × 100
Cs(0)

kde:

Cs(0) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den 0,

Cs(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den t.

IV.I.8 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

zkušební a referenční chemické látky a jejich čistota;

zkušební podmínky;

inokulum: charakter a místo (místa) odběru, koncentrace a jakákoli předběžná úprava;

podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy;

délka zkoušky a teplota;

v případě špatně rozpustných zkušebních látek použitý způsob zpracování;

použitá zkušební metoda; měly by být uvedeny vědecké důvody a vysvětlení pro veškeré změny postupu;

přehled dat;

veškeré pozorované projevy inhibice;

jakýkoli pozorovaný abiotický rozklad;

specifická analytická data o chemické látce, pokud existují;

analytická data o meziproduktech, pokud existují;

graf závislosti rozkladu v procentech na čase pro zkušební a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi iniciace, fázi rozkladu, 10denní období rozkladu a směrnici (příloha I). Vyhovuje-li zkouška kritériím jakosti, je možné v grafu použít střední hodnotu rozkladu v procentech v baňkách obsahujících zkušební látku;

rozklad v procentech po 10denním období rozkladu, v oblasti plató a na konci zkoušky.

IVA. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) - metoda C.4-A podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVA.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 - 40 mg DOC na litr) jako nominální jediný zdroj organického uhlíku se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.

Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace.

IVA 2 POPIS METODY

IVA 2.1 Aparatura

a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

b) Třepačka upravená pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;

d) Analyzátor DOC;

e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

f) Odstředivka;

IVA 2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v bodě I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVA 2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

Viz I.6.4,I.6.4.1,I.6.4.2 a I.6.5.

IVA 2.4 Příprava baněk

Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I.6.4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných látek na litr. Připraví se rovněž kontroly s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.

Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.

Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6).

Existuje-li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.

Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

IVA 2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola adsorpce

Baňka 8: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVA 2.6 Provedení zkoušky

Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense;

Před každým odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované nebo odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 -4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než -18 °C.

IVA 3 DATA A ZPRÁVY

IVA 3.1 Zpracování výsledků

Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).

Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledu dat.

IVA 3.2 Platnost výsledků

Viz bod I.5.2.

IVA 3.3 Zprávy

Viz bod I.8.

IVA 4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat.

ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC

1. LABORATOŘ

2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t0: mg·l-1

4. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l-1

5. STANOVENÍ UHLÍKU

Analyzátor uhlíku:

Baňka č.DOC po n dnech (mg·l-1)
0n1n2n3nx
Zkušební látka a inokulum1a1
a2
a, střední hodnota
Ca(t)
2b1
b2
b, střední hodnota
Cb(t)
Slepá zkouška s inokulem
bez zkušební látky
3c1
c2
c, střední hodnota
Cc(t)
4d1
d2
d, střední hodnota
Cd(t)
vzorec 001

6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT

Baňka č.Rozklad v % po n dnech
0n1n2n3nx
1vzorec 0020
2vzorec 0030
Střední hodnota*vzorec 0040

* Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.

Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.

7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

Čas (dny)
0t
DOC (mg·l-1) ve sterilní kontroleCs(0)Cs(t)
Cs(0) − Cs(t)
abiotický rozklad v % = ————— × 100
Cs(0)

8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

Zbylé množství zkušební
chemické látky na konci
zkoušky (mg·l-1)
Primární rozklad
v procentech
Sterilní kontrolaSb
Inokulované zkušební médiumSavzorec 005

IVB. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) - MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD - metoda C.4-B podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVB.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 - 40 mg DOC na litr) jako jediný zdroj organického uhlíku se inokuluje 0,5 ml odpadní vody na litr média. Směs se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 ± 2 °C.

Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace.

IVB.2 POPIS METODY

IVB.2.1 Aparatura

a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;

b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;

c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;

d) Analyzátor DOC;

e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;

f) Odstředivka.

IVB.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsaná v bodě I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

V této metodě se používá jako inokulum pouze 0,5 ml odpadní vody na litr, a proto je nutné do média dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků najeden litr výsledného média:

Roztok stopových prvků:

Síran manganatý tetrahydrát, MnSO4·4H2O39,9 mg
Kyselina boritá, H3BO357,2 mg
Síran zinečnatý heptahydrát, ZnSO4·7H2O42,8 mg
Heptamolybdenan hexaamonný, (NH4)6Mo7O2434,7 mg
Chelát Fe (FeCl3 s kyselinou ethylendiaminotetraoctovou)100,0 mg

Rozpustí se v ředicí vodě a doplní se touto vodou na 1 000 ml.

Vitaminový roztok:

Kvasničný extrakt15,0 mg

Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 μm, nebo se připraví čerstvě.

IVB.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.

Viz I.6.4.2 a I 6.5.

Použije se 0,5 ml na litr minerálního média.

IVB.2.4 Příprava baněk

Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují odpadní vodou z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I.6.4.2) v objemu 0,5 ml na litr. Připraví se rovněž slepé zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.

Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.

Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládána abioticky (viz I.6.6).

Existuje-li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.

Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

IVB.2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola adsorpce

Baňka 8: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVB.2.6 Provedení zkoušky

Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.

Před odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, odst. 4). Zfiltrované resp. odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 -4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než -18 °C.

IVB.3 DATA A ZPRÁVY

IVB.3.1 Zpracování výsledků

Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).

Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledů dat.

IVB.3.2 Platnost výsledků

Viz bod I.5.2.

IVB.3.3 Zprávy

Viz bod I.8.

IVB.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat.

MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD

1. LABORATOŘ

2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t0: mg·l-1

4. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi; mg·l-1

5. STANOVENÍ UHLÍKU

Analyzátor uhlíku:

Baňka č.DOC po n dnech (mg·l-1)
0n1n2n3nx
Zkušební látka a inokulum1a1
a2
a, střední hodnota
Ca(t)
2b1
b2
b, střední hodnota
Cb(t)
Slepá zkouška s inokulem
bez zkušební látky
3c1
c2
c, střední hodnota
Cc(t)
4d1
d2
d, střední hodnota
Cd(t)
vzorec 006

6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT

Baňka č.Rozklad po n dnech
0n1n2n3n4
1vzorec 0070
2vzorec 0080
Střední hodnota*vzorec 0090

* Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl.

Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity.

7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)

Čas (dny)
0t
DOC (mg·l-1) ve sterilní kontroleCs(0)Cs(t)
Cs(0) − Cs(t)
abiotický rozklad v % = ————— × 100
Cs(0)

8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)

Zbylé množství zkušební
chemické látky na konci
zkoušky (mg·l-1)
Primární rozklad
v procentech
Sterilní kontrolasb
Inokulované zkušební médiumsavzorec 010

IVC. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO (CO2) - MODIFIKOVANÁ STURMOVA ZKOUŠKA - metoda C.4-C podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVC.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební látky (10 - 20 mg DOC nebo TOC na litr), která je jediným zdrojem uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle regulovaným proudem vzduchu bez CO2. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím vznikajícího CO2 jímaného v roztoku hydroxidu barnatého nebo sodného, kde se stanoví titrací zbytkového hydroxidu nebo jako anorganický uhlík. Množství CO2 vzniklého ze zkušební látky (po korekci na CO2 pocházející z čistého inokula) se vyjádří v procentech TCO2. Stupeň biologického rozkladu může být také vypočten z doplňkového stanovení DOC na začátku a na konci inkubace.

IVC.2 POPIS METODY

IVC.2.1 Přístroje

a) Baňky na 2 - 5 l vybavené provzdušňovací trubicí dosahující až ke dnu nádoby a výstupnímo tvorem;

b) Magnetické míchačky pro zkoušení špatně rozpustných látek;

c) Absorpční lahv;

d) Zařízení pro regulaci a měření průtoku vzduchu;

e) Zařízení pro odstraňování CO2 při přípravě vzduchu bez CO2, popřípadě může být použita směs kyslíku bez CO2 a dusíku bez CO2 ve správném poměru (20 % O2 a 80 % N2) z lahví se stlačenými plyny;

f) Zařízení na stanovení CO2 buď titračně nebo pomocí analyzátoru anorganického uhlíku;

g) Zařízení pro membránovou filtraci (podle volby);

h) Analyzátor DOC (podle volby).

IVC.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVC.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVC.2.4 Příprava baněk

Jako příklad jsou uvedeny hodnoty pro baňky na 5 litrů obsahující 3 litry suspense. V případě použití menších objemů se hodnoty úměrně upraví, musí být ovšem zajištěno, aby bylo možné přesně měřit vznikající CO2.

Do každé baňky na 5 litrů se přenese 2 400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I.6.4.1 a I.65), aby koncentrace suspendovaných látek v konečném objemu 3 l inokulované směsi byla 30 mg·l-1. Eventuálně lze nejdříve zředit připravený kal v minerálním médiu na suspensi o koncentraci 500 - 1 000 mg·l-1 a poté přidat alikvotní části do baňky na 5 litrů, aby byla dosažena koncentrace 30 mg·l-1; zajistí se tím větší přesnost. Mohou být použity i jiné zdroje inokula (viz I.6.4.2).

Inokulovaná směs se přeš noc provzdušňuje vzduchem bez CO2, aby se ze systému odstranil oxid uhličitý.

Odděleně do dvojic baněk se ze zásobních roztoků přidá zkušební látka a referenční látka tak, aby koncentrace pocházející z chemických látek byla v rozmezí 10 až 20 mg DOC nebo TOC na litr; některé lahve se nasadí jako kontrola inokula bez přidání chemických látek. Spatně rozpustné látky se odváží nebo odměří přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III.

Podle potřeby se jedna baňka použije ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky, a to přidáním zkušební i referenční látky ve stejných koncentracích jako v ostatních baňkách.

Podle potřeby se další baňka použije k ověření, zda se zkušební látka nerozkládá abioticky, přičemž se použije roztok chemické látky bez inokula (viz I.6.6). Sterilizace se provádí přidáním vhodné koncentrace toxické látky.

Ve všech baňkách se upraví objem na 3 1 přídavkem minerálního média bez CO2. Podle potřeby lze odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha II, bod 4) a/nebo pro specifickou analýzu. Poté se na výstup plynů u baněk připojí absorpční lahve.

V případě použití hydroxidu barnatého se za každou baňku na 5 litrů zařadí tři absorpční lahve, každá obsahující 100 ml roztoku Ba(OH)2 o koncentraci 0,0125 mol·l-1. Roztok nesmí obsahovat sraženinu síranů a uhličitanu barnatého a jeho koncentrace musí být stanovena bezprostředně před použitím. Je-li použit hydroxid sodný, spojí se 2 absorpční lahve, z nichž druhá slouží jako kontrola, že byl veškerý CO2 zachycen v první absorpční lahvi. K tomuto účelu se hodí absorpční lahve opatřené sérovými uzávěry. Do každé absorpční lahve se přidá po 200 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,05 mol·l-1, což postačuje k absorpci veškerého oxidu uhličitého, který by se uvolnil při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného, i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů; korekce se provede odečtením množství uhličitanů ve slepém pokusu.

IVC.2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVC.2.6 Provedení zkoušky

Zkouška se zahájí probubláváním vzduchu bez CO2 suspensí při průtoku 30 - 100 ml·min-1. Za účelem analýzy obsahu CO2 se pravidelně odebírají vzorky absorbentu. Doporučuje se, aby se v průběhu prvních 10 dnů prováděly analýzy každý druhý až třetí den a dále pak každý pátý den až do 28. dne, což umožní rozpoznat období 10denního období rozkladu.

28. den se (nepovinně) odebere vzorek pro stanovení DOC a/nebo pro specifickou analýzu, změří se pH suspensí a poté se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl; provzdušňuje se přes noc, aby se odstranil CO2 přítomný v suspensi. Poslední analýza uvolněného CO2 se provede 29. den.

Ve dnech, kdy se provádí stanovení CO2, se odpojí absorpční lahev s hydroxidem barnatým bližší zkušební baňce a roztok hydroxidu barnatého se titruje 0,05M HCl za přítomnosti fenolftaleinu jako indikátoru. Zbývající dvě absorpční lahve se posunou k baňce a na konec řady se zařadí nová absorpční lahev se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125M hydroxidu barnatého. Titrace se provádějí podle potřeby, např. je-li pozorována v první absorpční lahvi zřetelná sraženina a před tím, než vznikne viditelná sraženina ve druhé absorpční lahvi, nebo alespoň jednou týdně. Jinou možností je provést při použití NaOH jako absorbentu odběr malého vzorku hydroxidu sodného pomocí injekční stříkačky (podle použitého analyzátoru uhlíku) z absorpční lahve, která je nejblíže k baňce. Vzorek se nastříkne přímo do IC-části analyzátoru uhlíku pro analýzu anorganického uhlíku.

Obsah druhé absorpční lahve se analyzuje pouze na konci zkoušky s cílem stanovit korekci na možný únik CO2.

IVC.3 DATA A ZPRÁVY

IVC.3.1 Zpracování výsledků

Množství CO2 zachyceného v absorpční lahvi je v případě titračního stanovení dáno vztahem:

mg CO2 = (100 × CB − 0,5 × V × CA) × 44

kde

V = objem HCl spotřebovaný při titraci 100 ml obsahu absorpční lahve (ml),

CB = koncentrace roztoku hydroxidu barnatého (mol·l-1),

CA = koncentrace roztoku kyseliny chlorovodíkové (mol·l-1).

Je-li CB 0,0125 mol·l-1 a CA 0,05 mol·l-1, je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)2 50 ml a hmotnost CO2 je dána vztahem:

0,05
——× 44 × počet ml HCl spotřebované při titraci = 1,1 × ml HCl
2

V tomto případě se tedy k přepočtu objemu HCl spotřebovaného při titraci na hmotnost vzniklého CO2 použije faktor 1,1.

S použitím příslušných výsledků titrace se vypočte hmotnost CO2 vzniklého ze samotného inokula a inokula se zkušební látkou a jejich rozdíl je hmotnost CO2 vzniklého ze samotné zkušební látky.

Je-li např. výsledkem titrace samotného inokula 48 ml a inokula se zkušební látkou 45 ml, je množství

CO2 z inokula = 1,1 × (50 − 48) = 2,2 mg,

CO2 z inokula a zkušební látky = 1,1 × (50 − 45)= 5,5 mg,

a tedy hmotnost CO2 vzniklého ze zkušební látky 3,3 mg.

Biologický rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:

vzniklý CO2 v mg × 100
rozklad v procentech = ——————————————
TCO2 × přidaná zkušební látka v mg

nebo

vzniklý CO2 v mg × 100
rozklad v procentech = ——————————————
TCO přidaný ve zkoušce v mg × 3,67

přičemž 3,67 je převodní faktor (44/12) pro uhlík a oxid uhličitý.

Rozklad v procentech se po každém období vypočte dosazením hodnoty TCO2 vypočítané pro každý den až do doby, kdy byl měřen.

Při zachytávání do NaOH se vypočte hmotnost vzniklého CO2, vyjádřeného jako anorganický uhlík v mg, vynásobením koncentrace anorganického uhlíku v absorpční lahvi objemem absorpčního roztoku.

Rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:

anorg. C ze zkušeb. baňky v mg − anorg. C ze slep. pokusu v mg
TCO2 v % = —————————————————————————× 100
TCO přidaný ve zkoušce v mg × 3,67

Úbytky DOC se (nepovinně) vypočítají podle bodu I.7. Tento výsledek spolu s ostatními výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

IVC.3.2 Platnost výsledků

Obsah anorganického uhlíku ve zkušební suspensi v minerálním médiu na začátku zkoušky musí být menší než 5 % TC a celkové množství CO2 vzniklé na konci slepé zkoušky s inokulem nesmí za normálních okolností překročit 40 mg na litr média. Jsou-li hodnoty větší než 70 mg CO2 na litr, měla by být data i experimentální postup kriticky přehodnoceny.

Viz také I.5.2.

IVC.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVC.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu: mg·l-1

Celkové množství uhlíku přidaného do baňky: mg C

TCO2: mg CO2

4. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l-1

5. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST

Metoda: Ba(OH)2 / NaOH/jiná

Čas (dny) CO2 uvolněný
ve zkoušce (mg)
CO2 uvolněný
ve slepé zkoušce
(mg)
Celkové množství
CO2 (průměr ve
zkoušce minus
průměr ve slepé
zkoušce) (mg)
TCO2

vzorec 011
12průměr34průměr1212průměr
0
n1
n2
n3
28

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)

Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)Slepý pokus (mg·l-1)Zkušební látka (mg·l-1)
0Cb(0)C0
28*Cb(t)Ct
* nebo na konci kultivace
Ct − Cb(t)
odstraněný DOC v % = (1 − ———— ) × 100
C0 − Cb(0)

7. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)

tvorba CO2 ve steril. podm. po 28 dnech v mg
abiotický rozklad v % = ———————————————————— × 100
TCO2

IVD. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ C.4-D podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVD.1 PODSTATA METODY

Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební chemické látky (100 mg zkušební látky na litr, dávající nejméně 50 - 100 mg TSK na litr), která je jediným zdrojem organického uhlíku, se míchá v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) na dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanoví buď měřením množství kyslíku (elektrolyticky produkovaného), který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce, nebo ze změn objemu nebo tlaku (nebo obojího) v aparatuře. Uvolněný CO2 se jímá v roztoku hydroxidu draselného nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, které je zkoušenou látkou spotřebováno (korigované na spotřebu kyslíku inokulem ve slepé zkoušce, která se provádí současně), se vyjádří v procentech TSK nebo CHSK. Popřípadě může být z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace vypočten primární biologický rozklad a z analýzy DOC úplný biologický rozklad.

IVD.2 POPIS METODY

IVD.2.1 Přístroje

a) vhodný respirometr;

b) regulátor teploty s přesností na ±1 °C nebo lepší;

c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);

d) analyzátor uhlíku (nepovinné).

IVD.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.

IVD.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula

Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.

Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.

IVD.2.4 Příprava baněk

S použitím zásobních roztoků se připraví samostatné sady roztoků zkušební chemické látky a referenční chemické látky v minerálním médiu o koncentraci odpovídající obvykle 100 mg chemické látky na litr (dávající nejméně 50 −100 mg TSK na litr).

TSK se vypočte z tvorby amoniových solí, pokud lze vyloučit nitrifikaci, v opačném případě by měl být výpočet založen na tvorbě dusičnanů (viz příloha II, bod 2).

Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 ± 0,2.

Špatně rozpustné látky se přidají v pozdějším stádiu (viz dále).

Má-li se stanovit toxicita zkušební látky, připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční i zkušební látku, a to ve stejných koncentracích jako v roztocích obsahujících jen jednu látku.

Požaduje-li se stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkušební látky obvykle o koncentraci 100 mg TSK na litr sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6).

Připravené objemy roztoků zkušební a referenční chemické látky se rozdělí alespoň duplicitně do baněk. Do dalších baněk se přidá pouze minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle potřeby směs roztoku zkušební a referenční chemické látky a sterilní roztok.

Je-li zkušební chemická látka špatně rozpustná, odváží se nebo odměří v tomto stádiu přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III. Do lahví pro absorpci CO2 se přidá hydroxid draselný, pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent.

IVD.2.5 Počet baněk v typické zkoušce

Baňka 1 a 2: Zkušební suspense

Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem

Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu

Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:

Baňka 6: Sterilní kontrola

Baňka 7: Kontrola toxicity

Viz také bod I.6.7.

IVD.2.6 Provedení zkoušky

V baňkách se nechá ustavit požadovaná teplota a vybrané baňky se inokulují přidáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, aby nebyla koncentrace suspendovaných látek větší než 30 mg·l-1. Zařízení se sestaví, spustí se míchačka, přezkouší se na vzduchotěsnost a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není třeba věnovat zkoušce žádnou zvláštní pozornost, kromě nezbytných odečtů a denní kontroly teploty a míchání.

Z pravidelných častých odečtů se podle postupu uvedeného výrobcem zařízení vypočte spotřeba kyslíku. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách, a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSKNH4 (platí pro látky obsahující dusík).

V případě potřeby se na začátku a na konci odebírá vzorek z respiračních nádobek pro stanovení DOC nebo pro specifickou analýzu (viz příloha II, bod 4). Při počátečním odběru z baňky se zajistí, aby byl znám objem zkušební suspense, která v baňce zůstala. Je-li kyslík spotřebováván látkami obsahujícími dusík, stanoví se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů za 28 dnů a vypočte se korekce na spotřebu kyslíku nitrifikací (příloha V).

IVD.3 DATA A ZPRÁVY

IVD.3.1 Zpracování výsledků

Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu kyslíku inokulem za stejnou dobu ve slepé zkoušce) se podělí hmotností zkušební látky v baňce. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:

spotř. O2 zk. chem. látkou v mg - spotř. O2 ve slep zkoušce v mg
BSK = ———————————————————————————————
hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg

= mg O2 na mg zkušební chemické látky.

Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:

BSK (mg O2 na mg chem. látky)
biolog. rozklad v % = % TSK = ———————————————— × 100
TSK (mg O2 na mg chem. látky)

nebo z rovnice:

BSK (mg O2 na mg chem. látky)
% COD = ———————————————— × 100.
COS (mg O2 na mg chem. látky)

Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.

Pro látky, jež obsahují dusík, se použije vhodná hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

V případě, že se provádí nepovinné stanovení organického uhlíku a/nebo specifické chemické látky, vypočte se stupeň rozkladu podle bodu I.7.

Všechny výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

IVD.3.2 Platnost výsledků

Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 - 30 mg O2 na litr a neměla by být větší než 60 mg·l-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.

Viz také I.5.2.

IVD.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVD.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg·l-1

Počáteční koncentrace v médiu, C0: mg·l-1

Objem zkušební baňky (V): ml

TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkušební látky (NH4, NO3):

4. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l-1

5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST

Čas (dny)
07142128
Spotřeba O2 (mg)
zkušební látkou
1
2
a, průměr
Spotřeba O2 (mg)
ve slepé zkoušce
3
4
b, průměr
Korigovaná BSK (mg)(a1 − bm)
(a2 − bm)
BSK na mg zkušební
látky
vzorec 012
vzorec 013
Rozklad v %
vzorec 014
D1(a1)
D2(a2)
Průměr*
V = objem média ve zkušební baňce

* Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.

Poznámka: Podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)

Den028Rozdíl
i) Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)(N)
ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg)
iii) Koncentrace dusitanů (mg N na litr)(N)
iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg)
ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent

7. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)

Analyzátor uhlíku:

Čas (dny)Slepá zkouška (mg·l-1)Zkušební látka(mg·l-1)
0(Cbl(0))(C0)
28*(Cbl(t))(Ct)
* nebo na konci inkubace
Ct − Cbl(t)
odstraněný DOC v % = (1 − ————— ) × 100
C0 − Cbl(0)

8. SPECIFICKÁ ANALÝZA (nepovinné)

Sb = koncentrace ve fyzikálně-chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech,

Sa = koncentrace v inokulované baňce po 28 dnech.

Sb − Sa
biologický rozklad v % = —————× 100
Sb

9. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)

a = spotřeba kyslíku ve sterilních baňkách po 28 dnech v mg,

a
spotřeba kyslíku na mg zkušební chemické látky = ———
C0V

(viz oddíl 1 a 3)

a × 100
abiotický rozklad v % = —————
C0V × TSK

IVE. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH - metoda C.4-E podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVE.1. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Roztok zkušební látky v minerálním médiu, obvykle o koncentraci 2 až 5 mg·l-1, se inokuluje malým množstvím mikroorganismů ze směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvičkách, v temnu a při konstantní teplotě. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím analýzy rozpuštěného kyslíku. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na souběžnou slepou zkoušku s inokulem se vyjádří jako TSK nebo CHSK.

IVE.2 POPIS METODY

IVE.2.1 Přístroje a pomůcky

a) Lahve pro analýzu BSK se skleněnými zátkami, např. na 250 − 300 ml.

b) Vodní lázeň nebo inkubátor pro udržování lahviček při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) v temnu.

c) Velké skleněné lahve na 2 − 5 l pro přípravu média a pro naplnění lahviček pro analýzu BSK.

d) Kyslíková elektroda a oxymetr nebo vybavení a činidla pro Winklerovu titrační metodu.

IVE.2.2 Příprava minerálního média

Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

Smísí se po 1 ml roztoků a) až d) a doplní se vodou na 1 litr.

IVE.2.3 Příprava inokula

Inokulum se obvykle získává z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Obvykle se použije jedna kapka (0,05 ml) až 5 ml filtrátu na litr média; k nalezení optimálního objemu dané odpadní vody může být nezbytné provést pokusy (viz I.6.4.2 a I.6.5).

IVE.2.4 Příprava lahviček

Minerální médium se alespoň 20 min silně provzdušňuje. Všechny série zkoušek se provedou s minerálním médiem ze stejné dávky. Obecně je médium připraveno k použití po 20 h stání při zkušební teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu; jeho obsah by měl být asi 9 mg·l-1 při 20 °C. Všechny operace přenosu média nasyceného vzduchem a jeho plnění se provedou tak, aby nevznikaly bublinky, např. pomocí nasávaček.

Připravují se shodné skupiny lahviček pro analýzu BSK pro stanovení se zkušební látkou a referenční látkou v souběžných sériích experimentů. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů, tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu, např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů, bylo možné provést alespoň dvě měření spotřeby kyslíku. K tomu, aby bylo možné rozpoznat 10denní období rozkladu, může být potřeba více lahviček.

Velké lahve se přibližně do jedné třetiny naplní provzdušněným médiem. Poté se zvlášť do jednotlivých velkých lahví přidá dostatečný objem zásobního roztoku zkušební látky a referenční látky, a. to obvykle tak, aby nebyla konečná koncentrace chemických látek větší než 10 mg·l-1. Ke slepému pokusu v další velké lahvi se nepřidávají žádné chemické látky.

S cílem zajistit, aby aktivita inokula nebyla omezená, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách pro analýzu BSK klesnout pod 0,5 mg·l-1. Toto omezuje koncentraci zkušební látky na 2 mg·l-1. Pro látky, které se špatně rozkládají, a pro látky s nízkou hodnotou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg·l-1. V některých případech se doporučuje provést souběžné série měření při dvou různých koncentracích zkušební látky, např. při 2 a 5 mg·l-1. Obvykle se TSK počítá na základě tvorby amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace nebo kdy dochází k nitrifikaci, se TSK vypočte na základě tvorby dusičnanů (TSKNO3, viz příloha II, bod 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, se provede korekce na změny analyticky stanovených koncentrací dusitanů a dusičnanů (viz příloha V).

Má-li být vyšetřena toxicita zkušební látky (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), je nezbytné nasadit další sérii lahviček.

Připraví se další velká láhev s provzdušněným minerálním médiem (naplněná asi do jedné třetiny objemu), do které se přidá zkušební a referenční chemická látka o konečné koncentraci obvykle stejné jako v případě ostatních velkých lahví.

Roztoky ve velkých lahvích se inokulují výstupem z druhého stupně čistírny odpadních vod (jedna kapka nebo 0,05 až 5 ml·l-1) nebo z jiného zdroje inokula, jako je např. říční voda (viz I.6.4.2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným minerálním médiem za použití hadičky, která sahá na dno, aby se dosáhlo dostatečného promíchání.

IVE.2.5 Počet lahviček v typické zkoušce

V typické zkoušce se použijí následující lahvičky:

nejméně 10 lahviček se zkušební látkou a inokulem (zkušební suspense),

nejméně 10 lahviček pouze s inokulem (slepá zkouška s inokulem),

nejméně 10 lahviček s referenční látkou a inokulem (kontrolní zkouška postupu),

a podle potřeby 6 lahviček se zkoušenou látkou, referenční látkou a inokulem (kontrola toxicity). Pro rozpoznání 10denního období rozkladu je však potřebný dvojnásobný počet lahviček.

IVE.2.6 Provedení zkoušky

Všechny připravené roztoky se ihned po přípravě rozdělí do příslušné skupiny lahviček pro analýzu BSK, a to pomocí hadičky zavedené do spodní čtvrtiny velké lahve (nikoliv ke dnu) tak, aby se všechny lahvičky pro analýzu BSK zcela naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. V lahvičkách se Winklerovou metodou nebo pomocí oxymetru ihned stanoví obsah rozpuštěného kyslíku k počátku zkoušky (k času nula). Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného (prvním Winklerovým činidlem). Před provedením zbývajících kroků Winklerovy metody se pečlivě uzavřené lahvičky obsahující kyslík vázaný ve formě hydratovaného oxidu manganitého skladují v temnu nejdéle 24 h při teplotě 10 − 20 °C. Zbývající souběžně připravené lahvičky se uzavřou tak, aby v nich nezůstaly bublinky vzduchu, a inkubují se v temnu při 20 °C. Každá série musí být doprovázena úplnou sérií slepého pokusu s inokulovaným médiem. Ve všech sériích se během 28 dnů inkubace v pravidelných intervalech (nejméně jednou týdně) stanoví alespoň ve dvou lahvičkách obsah rozpuštěného kyslíku.

Týdenní vzorky umožní stanovení rozkladu v procentech ve 14denním období rozkladu, zatímco vzorky odebírané každé 3 − 4 dny umožní rozpoznat 10denní období rozkladu, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.

U látek obsahujících dusík se provede korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci. K tomuto účelu se stanoví koncentrace rozpuštěného kyslíku oxymetrem a poté se z lahvičky pro analýzu BSK odebere vzorek pro stanovení dusitanů a dusičnanů. Z přírůstku koncentrace dusitanů a dusičnanů se vypočte množství spotřebovaného kyslíku (viz příloha V).

IVE.3 DATA A ZPRÁVY

IVE.3.1 Zpracování výsledků

Nejprve se vypočte BSK, ke které došlo po každé časové periodě, a to odečtením spotřeby kyslíku (v mg O2 na litr) ve slepém pokusu s inokulem od spotřeby, zkušební chemickou látkou. Takto korigovaná spotřeba se vydělí koncentrací zkušební látky (mg·l-1) a získá se specifická BSK v mg kyslíku na mg zkušební látky. Biologická rozložitelnost v procentech se vypočte jako podíl specifické BSK a specifické TSK (vypočtené podle přílohy II, bodu 2) nebo CHSK (stanovené analyticky, viz příloha II, bod 3), tedy:

spotř. O2 zk. chem. látkou v mg - spotř. O2 ve slep. pokusu v mg
BSK = ——————————————————————————————
hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg

= mg O2 na mg zkušební chemické látky.

BSK (mg O2 na mg zkušeb. chem. látky)
rozklad v % = ———————————————— × 100
TSK (mg O2 na mg zkušeb. chem. látky)

nebo

BSK (mg O2 na mg zkušeb. chem. látky)
rozklad v % = ———————————————————— × 100
COD (mg O2 na mg zkušeb. chem. látky)

Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.

Pro látky, jež obsahují dusík, se použije odpovídající hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

IVE.3.2 Platnost výsledků

Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu s inokulem by neměla být po 28 dnech vyšší než 1,5 mg·l-1. Vyšší hodnoty vyžadují přešetření experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku ve zkušebních lahvičkách by neměla nikdy klesnout pod 0,5 mg·l-1. Takto nízké úrovně kyslíku jsou platné pouze tehdy, lze-li použitou metodou stanovení rozpuštěného kyslíku tak nízké úrovně přesně změřit.

Viz také I.5.2.

IVE.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVE.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace zásobního roztoku: mg·l-1

Počáteční koncentrace v lahvičce: mg·l-1

TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkušební látky

4. INOKULUM

Zdroj:

Provedená úprava:

Předběžná úprava, pokud byla provedena:

Koncentrace v reakční směsi: mg·l-1

5. STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU:

Metoda: Winklerova metoda / oxymetr

Analýzy lahviček

Doba kultivace (d)Rozpuštěný kyslík
(mg·l-1)
0n1n2
Slepá zkouška (bez
chemické látky)
1C1
2C2
Průměrvzorec 015
Zkušební chemická
látka
1a1
2a2
Průměrvzorec 016

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.

6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)

Doba kultivace0n1n2n3
i) Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)
ii) Změna koncentrace dusičnanů (mg N na litr)
iii) Kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)
iv) Koncentrace dusitanů (mg N na litr)
v) Změna koncentrace dusitanů (mg N na litr)
vi) Kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)
iii + vi) Celkový kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)

7. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: ROZKLAD V PROCENTECH

Úbytek po n dnech (mg·l-1)
n1n2n3
LAHVIČKA 1: (mt0 − mtx) - (mb0 − mbx)
LAHVIČKA 2: (mt0 − mtx) - (mb0 − mbx)
LAHVIČKA 1: vzorec 017
LAHVIČKA 2: vzorec 018
vzorec 019

* Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.

mt0 = hodnota pro zkušební lahvičku v čase 0

mtx = hodnota pro zkušební lahvičku v čase x

mb0 = hodnota pro slepý pokus v čase 0

mbx = hodnota pro slepý pokus v. čase x

Použijí se rovněž korekce na nitrifikaci z bodu iii + vi v oddílu 6.

8. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU

Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je (mbo − mb28) v mg·l-1. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg·l-1.

IVF. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY MITI - metoda C.4-F podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IVF.1 PODSTATA METODY

Měření spotřeby kyslíku v míchaném roztoku nebo suspensi zkušební chemické látky v minerálním médiu inokulovaném speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismů se provádí automaticky po dobu 28 dnů za tmy v uzavřeném respirometru při 25 ± 1 °C. Uvolňovaný oxid uhličitý se jímá v hydroxidu sodném. Biologická rozložitelnost se vyjádří jako spotřeba kyslíku (korigovaná na slepý pokus) vyjádřená v procentech teoretické spotřeby kyslíku (TSK). Primární biologická rozložitelnost vyjádřená v procentech se rovněž vypočte z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace, popřípadě z analýzy DOC.

IVF.2 POPIS METODY

IVF.2.1 Přístroje a pomůcky

a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr standardně vybavený 6 baňkami na 300 ml opatřenými uzávěry obsahujícími absorbent CO2;

b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeň nastavená na 25 ± 1 °C;

c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);

d) analyzátor uhlíku (nepovinné).

IVF.2.2 Příprava minerálního média

a)

Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO48,50
Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO421,75 g
Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát, Na2HPO4·12H2O44,60 g
Chlorid amonný, NH4Cl1,70 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,2.

b)

Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O22,50 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

c)

Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl227,50 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

d)

Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O0,25 g
Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Spojí se po 3 ml roztoků a), b), c), a d) a doplní se na 1 litr.

IVF.2.3 Příprava inokula

Odeberou se čerstvé vzorky nejméně z deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řeky, jezera a moře se odeberou litrové vzorky kalu, povrchových půd, vody atd., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyplavených látek a ustálení se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou.

Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na aktivaci kalu a kapalina se 23½ h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije přibližně jedna třetina celkového objemu supernatantu a k usazenému materiálu se přidá stejný objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a dihydrogenfosforečnanu draselného, a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována při 25 ± 2°C, pH má být 7 ± 1, kal se má dobře usazovat, provzdušňování musí být za všech okolností dostatečné, mají být přítomni prvoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé tři měsíce. Inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace, ale ne později než po čtyřech měsících. Proto se v pravidelných intervalech jednou za tři měsíce odebírají vzorky z 10 míst.

K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtrovaného supernatantu čerstvě odebraného kalu pocházejícího z deseti zdrojů a směs se kultivuje podle výše uvedeného postupu. Kal se použije jako inokulum až 18 − 24 h po uvedeném zpracování.

IVF.2.4 Příprava baněk

Připraví se následujících 6 baněk:

Baňka č. 1: zkušební chemická látka v ředicí vodě, 100 mg·l-1

Baňky č. 2, 3, 4: zkušební chemická látka v minerálním médiu, 100 mg·l-1

Baňka č. 5: referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu, 100 mg·l-1

Baňka č. 6: pouze minerální médium

Špatně rozpustné chemické látky se odváží nebo odměří, nebo se zpracují podle přílohy III, s výjimkou těch, u nichž nesmějí být použita rozpouštědla ani emulgátory. Do speciálních uzávěrů všech lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

IVF.2.5 Provedení zkoušky

Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspense), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby byla výsledná koncentrace kalu 30 mg·l-1. Do lahve č. 1 se inokulum nepřidává, slouží jako abiotická kontrola. Zařízení se sestaví, přezkouší se na vzduchotěsnost, spustí se míchačka a v temnu se zahájí měření spotřeby kyslíku. Denně se kontroluje teplota, míchání, coulometrický zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenají se všechny změny barvy obsahu baněk. Spotřeba kyslíku pro 6 baněk se odečítá přímo, např. šestikanálovým zapisovačem, čímž se získá křivka BSK Na konci kultivace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách a stanoví se zbytková koncentrace zkušební chemické látky a jejích produktů rozkladu a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také koncentrace DOC (postup podle přílohy II, bodu 4). Zvláštní pozornost je třeba věnovat těkavým látkám. Pokud se předpokládá nitrifikace, stanoví se podle možnosti koncentrace dusičnanů a dusitanů.

IVF.3 DATA A ZPRÁVY

IVF.3.1 Zpracování výsledků

Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu inokulem za stejnou dobu ve slepém pokusu) se podělí hmotností použité zkušební látky. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:

spotř. O2 zk. chem. látkou v mg − spotř. O2 ve slepé zkoušce v mg
BSK = ————————————————————————————————
hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg

= mg O2 na mg zkušební chemické látky.

Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:

BSK (mg O2 na mg chem. látky)
biolog. rozklad v % = % TSK = ————————————————— × 100.
TSK (mg O2 na mg chem. látky)

Pro směsi se TSK vypočte z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché sloučeniny. Použije se odpovídající hodnota TSK (TSKNH4 nebo TSKNO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

Vypočte se primární biologický rozklad v procentech z úbytku specifické (výchozí) chemické látky (viz I.7.2):

Sb − Sa
Dt = (1 − ————— × 100
Sb

Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta zkušební chemické látky v baňce č. 1, zaznamená se to a jako koncentrace zkušební látky (Sb) po 28 dnech se pro výpočet biologické rozložitelnosti dosadí tato koncentrace.

Stanovuje-li se koncentrace DOC (nepovinné), vypočte se konečná hodnota biologického rozkladu v procentech podle vztahu:

Ct − Cbt
Dt = (1 − ————— × 100
C0 − Cb0

jak je uvedeno v bodě I.7.1. Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta DOC v baňce č. 1, použije se při výpočtu biologického rozkladu v procentech tato koncentrace DOC.

Všechny výsledky se zaznamenají do přehledu dat.

IVF.3.2 Platnost výsledků

Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 - 30 mg O2 na litr a neměla by být větší než 60 mg·l-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 - 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.

Viz také I.5.2.

V případě, že rozklad anilinu vypočtený ze spotřeby kyslíku nepřekročí po 7 dnech 40 % a po 14 dnech 65 %, považuje se zkouška za neplatnou.

IVF.3.3 Zprávy

Viz I.8.

IVF.4 PŘEHLED DAT

Dále je uveden příklad přehledu dat:

ZKOUŠKA MITI (I)

1. LABORATOŘ

2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA

Název:

Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1

Počáteční koncentrace chemické látky v médiu, C0: mg·l-1

Objem reakční směsi, V: ml

TSK: mg O2 na litr

4. INOKULUM

Místa odběru kalu:

1)...6)...
2)...7)...
3)...8)...
4)...9)...
5)...10)...

Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci se syntetickými splašky mg·l-1.

Objem aktivovaného kalu v litru konečného média = ... ml

Koncentrace kalu v konečném médiu = ... mg·l-1

5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST

Typ použitého respirometru:

Čas (dny)
07142128
Spotřeba O2 (mg)
zkušební látkou
a1
a2
a3
Spotřeba O2 (mg)
ve slepé zkoušce
b
Korigovaná spotřeba
O2(mg)
(a1 − b)(a2 − b)(a3 − b)
BSK na mg zkušební
látky
vzorec 020Baňka 1
Baňka 2
Baňka 3
Rozklad v %

vzorec 021
1
2
3
Průměr*

Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku.

* Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.

6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)

Analyzátor uhlíku:

BaňkaDOCúbytek
DOC v %
Průměr
Naměřená
hodnota
Korigovaná
hodnota
Voda + zkušební látkaa
Kal + zkušební látkab1b1 − c
Kal + zkušební látkab2b2 − c
Kal + zkušební látkab3b3 − c
Kontrolní slepá zkouškac
a − (b − c)
odstraněný DOC v % = ————— × 100
a

7. DATA ZE SPECIFICKÉ CHEMICKÉ ANALÝZY

Zbytkové množství zkušební
chemické látky na konci zkoušky
Rozklad v %
Slepá zkouška s vodouSb
Inokulované médiumSa1
Sa2
Sa3
Sb − Sa
rozklad v % = ——— × 100
Sb

Rozklad v % se vypočte pro baňky a1, a2, a3.

8. POZNÁMKY

Připojí se křivka závislosti BSK na čase, je-li k dispozici.

PŘÍLOHA I

ZKRATKY A DEFINICE

DO: Rozpuštěný kyslík (dissolved oxygen) (mg·l-1) je koncentrace kyslíku, který je rozpuštěn ve vodném vzorku.

BSK: Biochemická spotřeba kyslíku (biochemical oxygen demand, BOD) (g) je množství kyslíku, jež je v průběhu metabolizace zkušební látky spotřebováno mikroorganismy; vyjadřuje se také jako spotřeba kyslíku v gramech na gram zkušební látky. (Viz metoda C.5).

CHSK: Chemická spotřeba kyslíku (chemical oxygen demand, COD) (g) je množství kyslíku, jež je spotřebováno v průběhu oxidace zkušební látky horkým kyselým dichromanem; je měřítkem množství přítomných oxidovatelných látek; vyjadřuje se také v gramech kyslíku spotřebovaného na gram zkušební látky. (Viz metoda C.6).

DOC: Rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový organický uhlík, který je přítomný v roztoku nebo projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm nebo zůstane v supernatantu po odstřeďování po dobu 15 min při zrychlení 40 000 m·s-2 (asi 4 000 g).

TSK: Teoretická spotřeba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; vypočte se z molekulového vzorce látky (viz příloha II, bod 2) a vyjadřuje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkušební látky.

TCO2: Teoretický oxid uhličitý (theoretical carbon dioxide, ThCO2) je množství oxidu uhličitého, které by mělo vzniknout ze známého nebo změřeného obsahu uhlíku ve zkušební látce za předpokladu její úplné mineralizace; vyjadřuje se v mg oxidu uhličitého uvolněného z 1 mg zkušební látky.

TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je součtem organického uhlíku v roztoku a v suspensi.

IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon).

TC: Celkový uhlík (total carbon) je součtem organického a anorganického uhlíku ve vzorku.

Primární biologický rozklad:

jsou změny chemické struktury látky způsobené biologickým působením, vedoucí ke ztrátě specifických vlastnosti látky.

Úplný biologický rozklad (aerobní):

je stupeň rozkladu látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buněčné hmoty (biomasy).

Snadno biologicky rozložitelná:

je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak přísné, že lze předpokládat, že se látky budou ve vodném prostředí za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.

Biologicky rozložitelná:

je klasifikace chemických látek, pro něž existuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.

Odstranitelnost:

je náklonnost látek k jejích odstranění při biologickém čištění odpadních vod, aniž by byl nepříznivě ovlivněn normální průběh čisticích pochodů. Látky snadno biologicky rozložitelné jsou obecně odstranitelné, avšak ne všechny rozložitelné látky jsou odstranitelné. Mohou zde působit také abiotické procesy.

Fáze iniciace:

je doba, ve zkoušce na úbytek rozpuštěného organického uhlíku, od inokulace do dosažení alespoň 10% biologického rozkladu. Fáze iniciace je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.

Doba rozkladu:

je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosažitelné úrovně rozkladu.

10denní období rozkladu:

je 10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10% rozkladu.

PŘÍLOHA II

VÝPOČET A STANOVENÍ NĚKTERÝCH SOUHRNNÝCH PARAMETRŮ

V závislosti na zvolené zkušební metodě se vyžaduje určení některých souhrnných parametrů.

V následujícím oddíle je popsán výpočet těchto hodnot. Využití těchto parametrů je popsáno u jednotlivých metod.

1. Obsah uhlíku

Obsah uhlíku se počítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví analýzou prvků ve zkušební látce.

2. Teoretická spotřeba kyslíku (TSK)

Teoretickou spotřebu kyslíku (TSK) lze vypočítat ze znalosti elementárního složení nebo z výsledků analýzy prvků. Pro látku

CcHhClclNnNanaOoPpSs

bez nitrifikace,

16[ 2c + ½ (h − cl − 3n) + 3s + 5/2 p + ½ na − o]
*TSKNH4 = ——————————————————————— v mg/mg
M

* Poznámka. M je molekulová hmotnost.

nebo s nitrifikací,

16[ 2c + ½ (h − cl) + 5/2 n + 3s + 5/2p + ½ na − o]
TSKNH4 = ———————————————————————
M

3. Chemická spotřeba kyslíku (CHSK)

Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) se stanoví metodou C.6.

4. Rozpuštěný organický uhlík (DOC)

Rozpuštěným organickým uhlíkem je podle definice organický uhlík přítomný ve vodném roztoku chemické látky nebo směsi, který projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm.

Odeberou se vzorky ze zkušebních nádob a ihned se filtrují pomocí filtračního zařízení s vhodným membránovým filtrem. Prvních 20 ml (toto množství může být při použití malých filtrů zmenšeno) se odstraní. 10 - 20 ml, nebo v případě nástřiku menší objem (objem závisí na množství potřebném pro analýzu), se uschová pro analýzu uhlíku. Koncentrace DOC se stanoví pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umožňuje přesné stanovení koncentrace uhlíku, která je menší nebo rovna 10 % počáteční koncentrace DOC použité ve zkoušce.

Zfiltrované vzorky, které není možné analyzovat ve stejný pracovní den, se uchovávají v ledničce 48 h při 2 - 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než -18 °C.

Poznámky:

Membránové filtry jsou často impregnovány povrchově aktivními látkami za účelem jejich hydrofilizace. Filtr tedy může obsahovat až několik mg rozpustného organického uhlíku, který může ovlivnit stanovení biologické rozložitelnosti.

Povrchově aktivní látky a jiné rozpustné organické látky se z filtrů odstraňují vyvařením třikrát jednu hodinu v deionizované vodě. Filtry lze poté skladovat 1 týden ve vodě. Při použití filtračních patron pro jedno použití se musí u každé šarže ověřit, zda neobsahuje rozpustný organický uhlík.

V závislosti na typu membránového filtru může docházet k adsorpci zkušební látky na filtru. Doporučuje se ověřit, zda k adsorpci zkušební chemické látky na filtru nedochází.

Místo filtrace lze použít k rozlišení TOC od DOC odstřeďování při 40 000 m·s-1 (4 000 g) po dobu 15 min. Tato metoda však není spolehlivá při počáteční koncentraci DOC < 10 mg·l-1, protože buď nelze odstranit všechny bakterie, nebo se zpětně rozpouští uhlík, který je součástí bakteriální plasmy.

LITERATURA

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 12th ed., Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65.

Wagner, R. von Wasser, 1976, vol 46, 139.

DIN-Entwurf 38 409, Teil 41 - Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser-und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrössen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.

Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13(1), 169.

PŘÍLOHA III

VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ŠPATNĚ ROZPUSTNÝCH LÁTEK

Při zkouškách biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek si zaslouží zvláštní pozornost následující aspekty.

Zatímco odběr vzorků homogenních kapalin je problémem jen zřídka, u tuhých látek se doporučuje provést homogenizaci vhodnými prostředky, aby v důsledku nehomogenity nedošlo k chybám. Zvláštní pozornost musí být věnována odběrům reprezentativních vzorků o několika miligramech ze směsí látek, které obsahují velké množství nečistot.

V průběhu zkoušek lze použít různé způsoby míchání. Je třeba věnovat pozornost tomu, aby míchání bylo přiměřené právě pro udržení látky v disperzi a nedocházelo k přehřívání, nadměrnému pěnění a nadměrným třecím silám.

Může se použít emulgátor vytvářející stabilní disperzi chemické látky. Nesmí být toxický pro bakterie a nesmí se biologicky rozkládat nebo pěnit za zkušebních podmínek.

Stejná kritéria jako pro emulgátory platí i pro rozpouštědla.

U tuhých zkušebních látek se nedoporučuje používat tuhé nosiče, mohou však být vhodné v případě olej ovitých látek.

Použijí-li se pomocné látky, jako jsou emulgátory, rozpouštědla a nosiče, musí být proveden slepý pokus s pomocnou látkou.

Pro studium biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek lze použít kteroukoli ze tří respirometrických zkoušek (zkouška na úbytek CO2, na BSK, zkouška MITI).

LITERATURA

— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, 16, 833.

— Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

PŘÍLOHA IV

VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI LÁTEK POTENCIÁLNĚ TOXICKÝCH PRO INOKULUM

Je-li chemická látka podrobena zkoušení snadné biologické rozložitelnosti a jeví se jako biologicky nerozložitelná, doporučuje se postupovat při požadavku rozlišit inhibiční působení od odolnosti látky vůči rozkladu následujícím způsobem (Reynolds et al., 1987).

Ve zkouškách toxicity i ve zkouškách biologické rozložitelnosti se použijí podobná nebo stejná inokula.

K posouzení toxicity chemických látek zkoušených ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti se doporučuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivovaného kalu (směrnice 88/302/EHS), stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci těchto metod.

Nemá-li dojít k inhibici z důvodu toxicity, měla by být koncentrace zkušební látky použitá ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti menší než 1/10 hodnoty EC50 (nebo menší než EC20) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC50 > 300 mg·l-1 pravděpodobně nemají při zkouškách snadné biologické rozložitelnosti toxické účinky.

Hodnoty EC50 < 20 mg·l-1 mohou při následném zkoušení působit potíže. Měly by být použity nízké koncentrace, což vyžaduje použít přísné a citlivé zkoušky v uzavřených lahvičkách nebo materiál značený 14C. Použití vyšších koncentrací zkušební látky může být popřípadě umožněno nasazením aklimatizovaného inokula. V tomto případě se však ztrácí specifické kritérium zkoušky snadné biologické rozložitelnosti.

LITERATURA

Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, 16, 2259.

PŘÍLOHA V

KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

Chyby způsobené tím, že při stanovení spotřeby kyslíku ve zkouškách látek, které neobsahují dusík, není vzata v úvahu nitrifikace, nejsou významné (nejsou větší než 5 %), i když je oxidace amoniakálního dusíku ve zkušebních nádobách a ve slepém pokusu nepravidelná. U zkušebních látek obsahujících dusík může dojít ke značným chybám.

Dochází-li k nitrifikaci, avšak nikoli úplné, musí být spotřeba kyslíku reakční směsí korigována na množství kyslíku spotřebovaného na oxidaci amoniaku a amonných iontů na dusitany a dusičnany, jsou-li změny koncentrace dusitanů a dusičnanů během kultivace stanoveny pomocí následujících rovnic:

2 NH4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCl + 2 H2O (1)

2 HNO2 + O2 = 2 HNO3 (2)

Celkově:

2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O (3)

Podle rovnice 1 je spotřeba kyslíku při oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH4Cl na dusitan 96 g, tzn., že přepočítávací faktor je 3,43 (96/28). Stejně tak je podle rovnice 3 spotřeba kyslíku při oxidaci na dusičnan 128 g, tzn. přepočítávací faktor je 4,57 (128/28).

Protože popsané reakce následují po sobě, přičemž jsou realizovány odlišnými druhy bakterií, může koncentrace dusitanů stoupat i klesat; při poklesu roste odpovídajícím způsobem koncentrace dusičnanů. Spotřeba kyslíku při tvorbě dusičnanů se tedy vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusičnanů faktorem 4,57, zatímco spotřeba kyslíku při tvorbě dusitanů se vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusitanů faktorem 3,43, nebo při poklesu obsahu dusitanů se ztráty kyslíku vypočtou vynásobením poklesu koncentrace faktorem -3,43.

To znamená:

spotřeba O2 při tvorbě dusičnanů = 4,57 × přírůstek koncentrace dusičnanů (4)

spotřeba O2 při tvorbě dusitanů = 3,43 × přírůstek koncentrace dusitanů (5)

ztráta O2 při úbytku dusitanů: = −3,43 × pokles koncentrace dusitanů (6)

Tedy

spotřeba O2 při nitrifikaci = ± 3,43 × změna koncentrace dusitanů + 4,57 × změna koncentrace dusičnanů (7)

a proto

spotřeba O2 v důsledku oxidace C = celková pozorovaná spotřeba - spotřeba v důsledku nitrifikace (8)

Jinými slovy, pokud se stanoví pouze celkový oxidovaný N, je možno za spotřebu kyslíku v důsledku nitrifikace považovat v prvém přiblížení hodnotu 4,57 × přírůstek oxidovaného dusíku.

Korigovaná hodnota spotřeby kyslíku v důsledku oxidace C se potom porovnává s TSK NH3 vypočítanou podle přílohy II.

V. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI - BIOCHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU - metoda C.5 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

V.1 METODA

V.1.1 ÚVOD

Metoda je určena pro měření biochemické spotřeby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek.

Data získaná při této zkoušce platí pro látky rozpustné ve vodě; těkavé látky a látky s nízkou rozpustností ve vodě lze touto metodou alespoň v zásadě rovněž zkoušet.

Metodu lze použít pouze pro organické látky, které nemají v koncentracích používaných při zkoušce inhibiční účinek na bakterie. Není-li daná látka při koncentracích používaných ve zkoušce rozpustná, může být nezbytné použít pro dosažení dobré dispergace zkušebního materiálu zvláštní postupy, např. dispergaci ultrazvukem.

Informace o toxicitě chemické látky mohou být užitečné při interpretaci nízkých hodnot výsledku zkoušky a při volbě vhodných zkušebních koncentrací.

V.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) je definována jako množství rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého objemu roztoku látky za předepsaných podmínek.

Výsledky se vyjadřují v gramech spotřeby kyslíku (BSK) na 1 g zkušební látky.

V.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Je žádoucí použít vhodnou referenční látku pro kontrolu aktivity inokula.

V.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vhodném, dobře provzdušněném médiu se inokuluje mikroorganismy a kultivuje se v temnu za stálé, definované teploty.

BSK se stanoví z rozdílu mezi obsahem rozpuštěného kyslíku na začátku a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejméně pět dní a nejdéle 28 dní.

Souběžně musí být provedena slepá zkouška bez obsahu zkušební látky.

V.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Stanovení BSK nelze považovat za ověřené stanovení biologické rozložitelnosti látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za screeningovou zkoušku.

V.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

Připraví se předběžný roztok nebo disperse zkušební látky o koncentraci vhodné pro použitou metodu. Poté se stanoví BSK některou vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní standardizovanou metodou.

V.2 DATA A HODNOCENÍ

BSK předběžného roztoku se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na BSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.

V.3 ZPRÁVY

Uvede se použitá metoda.

Biochemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří platných měření.

Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav, toxické účinky a vlastní složení zkušební látky.

Použití přísad pro inhibici biologické nitrifikace musí být uvedeno.

V.4 LITERATURA

Seznam příkladů standardizovaných metod:

NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.

NBN 407: Biochemical oxygen demand.

NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV).

The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.

ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.

VI. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI - CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU - metoda C.6 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

VI.1 METODA

VI.1.1 ÚVOD

Metoda je určena pro měření chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek prováděné standardním dohodnutým způsobem za pevně stanovených laboratorních podmínek.

Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků jsou užitečné informace o chemickém vzorci látky (např. zda jde o soli halogenů, železnaté soli organických sloučenin, organické sloučeniny chloru).

VI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky, která se vyjadřuje jako ekvivalentní množství kyslíku oxidačního činidla spotřebovaného látkou za pevně stanovených laboratorních podmínek.

Výsledek se vyjadřuje jako množství spotřebovaného kyslíku (COD) v gramech na 1 g zkušební látky.

VI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

VI.1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vodě se za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru oxiduje dichromanem draselným v prostředí koncentrované kyseliny sírové pod zpětným chladičem. Přebytečný dichroman se stanoví titrací odměrným roztokem síranu amonno-železnatého.

U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý*.

VI.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

Vzhledem k dohodnutým podmínkám stanovení je CHSK „ukazatelem oxidovatelnosti“ a jako takový se používá pro hodnocení organických látek.

Ve zkoušce mohou rušit chloridy; na stanovení CHSK mohou mít rovněž vliv anorganické redukční a oxidační látky.

U některých cyklických sloučenin a u řady těkavých sloučenin (např. u nižších mastných kyselin) nedochází v této zkoušce k úplné oxidaci.

VI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

Připraví se počáteční roztok nebo disperse látky tak, aby bylo dosaženo CHSK od 250 do 600 mg·l-1.

Poznámky:

U špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek lze jemně rozmělněnou látku nebo kapalinu v množství odpovídajícím 5 mg CHSK odvážit a vpravit přímo do experimentální aparatury s vodou.

Často je výhodné, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit CHSK upravenou metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnávačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto upravenou metodou lze často úspěšně kvantifikovat i látky, u nichž je stanovení konvenční metodou obtížné - např. kyselinu octovou. Metoda však také selhává v případě pyridinu. Zvýší-li se koncentrace dichromanu draselného předepsaná v (1), na 0,25 N (0,0416 M), usnadní se přímé navažování 5 - 10 mg látky, což je důležité pro stanovení CHSK látek obtížně rozpustných ve vodě (2).

Jinak se CHSK stanoví vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní metodou.

VI.2 DATA A HODNOCENÍ

CHSK obsahu experimentální baňky se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na CHSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.

VI.3 ZPRÁVY

Uvede se odkaz na použitou metodu.

Chemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří měření. Jsou-li známy, musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav a základní vlastnosti zkušební látky.

Uvede se použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.

VI.4 LITERATURA

(1) Kelkenberg, H. Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 8, 146.

(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

Seznam příkladů normovaných metod:

NBNT 91-201Determination of the chemical oxygen demand.
ISBN O 11 7512494Chemical oxygen demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
NF T 90-101Determination of the chemical oxygen demand.
DS 217Water analysis —Determination of the chemical oxygen demand.
DIN 38409-H-41Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
NEN 3235 5.3Bepaling van bet chemisch zuurstofverbruik.
ISO 6060Water Quality: Chemical oxygen demand dichromate methods.

VII. METODA PRO STANOVENÍ ABIOTICKÉHO ROZKLADU - HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH - metoda C.7 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

VII.1 METODA

Metoda je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).

VII.1.1 ÚVOD

Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. Tato reakce má zvláštní význam u látek, které jsou málo biologicky rozložitelné; může ovlivnit stálost látky v životním prostředí.

Většina reakcí hydrolýzy probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, a poločasy jsou tedy nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků získaných s laboratorními koncentracemi na podmínky v životním prostředí.

Mimoto byly u několika typů chemických sloučenin publikovány příklady uspokojivé shody výsledků naměřených v čisté vodě a v přírodních vodách (2).

Při provádění této zkoušky je užitečné znát hodnotu tlaku pár dané látky.

Metoda je použitelná pouze pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty mohou ovlivnit výsledky.

Chování látek při hydrolýze by mělo být zkoumáno při hodnotách pH, které se obvykle vyskytují v životním prostředí (pH 4 − 9).

VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou. Tuto reakci lze znázornit prostou výměnou skupiny X za skupinu OH:

RX + HOH → ROH + HX   (1)

Rychlost, kterou klesá koncentrace látky RX, je dána vztahem:

rychlost = k·[H2O]·[RX] (2)

Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce ve velkém přebytku, označuje se obvykle tento typ reakce jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem:

kpozorov. = k·[H2O] (3)

Tuto konstantu lze určit pro danou hodnotu pH a teplotu T z výrazu:

2,303C0
kpozorov. = ——— × log (4)
tCt

kde

t = čas,

C0 = koncentrace látky v čase 0,

Ct = koncentrace látky v čase t,

2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a dekadickým logaritmem.

Koncentrace se vyjádří v g·l-1 nebo v mol·l-1.

Konstanta kpozorov. má rozměr [čas]-1.

„Poločas“ t½ je definován jako doba potřebná pro snížení koncentrace látky o 50 %,

Ct = 1/2·C0 (5)

Z rovnic (4) a (5) plyne, že

t½ = 0,693 /kpozorov. (6)

VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.

Jako referenční látky byly použity následující látky (1):

Kyselina acetylsalicylová (aspirin),

O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4-yl)fosforothioát (dimpylát, diazinon).

VII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Látka se rozpustí ve vodě v nízké koncentraci; pH a teplota se regulují.

Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.

Sestrojí se graf závislosti logaritmů koncentrací na čase, a je-li závislost lineární, lze zjistit rychlostní konstantu reakce prvního řádu ze směrnice přímky (viz bod 2).

Není-li možné stanovit rychlostní konstantu pro danou teplotu přímo, je obvykle možné odhadnout ji pomocí Arrheniovy rovnice, která udává teplotní závislost rychlostních konstant. Z průběhu lineární závislosti logaritmů rychlostních konstant, získaných při vhodných teplotách, na převrácené hodnotě absolutní teploty (K) lze extrapolací získat hodnotu rychlostní konstanty, kterou nebylo možné stanovit přímo.

VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

V odkazu (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.

Reprodukovatelnost závisí zejména na regulaci pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve speciálních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.

VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

VII.1.6.1 Reakční činidla

VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky

Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0.

K tomuto účelu se za použití chemikálií čistoty p.a. a destilované nebo deionizované vody připraví pufrační roztoky. Některé příklady pufračních roztoků jsou uvedeny v doplňku.

Použitý pufrační roztok může mít vliv na rychlost hydrolýzy; je-li tomu tak, je třeba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporučuje použít namísto fosforečnanových pufračních roztoků boritanové a acetátové pufrační roztoky.

Není-li známa hodnota pH pufračních roztoků při zkušební teplotě, lze ji stanovit s přesností na ±0,1 pH-metrem kalibrovaným při zvolené teplotě.

VII.1.6.1.2 Zkušební roztoky

Zkušební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by neměla překročit 0,01 mol·l-1 nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.

Použití organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě.

Množství tohoto rozpouštědla by mělo být menší než 1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy.

VII.1.6.2 Aparatura

Použijí se skleněné baňky se zabroušenými zátkami, pro něž není vhodné používat mazací tuk.

Pokud jsou chemická látka nebo pufrační roztok těkavé, nebo provádí-li se zkouška při zvýšené teplotě, upřednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavřené a s omezeným prostorem nad roztokem.

VII.1.6.3 Analytická metoda

Použitá metoda musí být specifická pro stanovení zkušební látky při zkušebních koncentracích a může být i kombinací vhodných analytických technik.

Použitá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně přesná a citlivá pro zjištění úbytku počáteční koncentrace o 10 %.

VII.1.6.4 Zkušební podmínky

Zkoušky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použití termostatované lázně nastavené na zvolenou teplotu s tolerancí ±0,5 °C. Teplota se udržuje a měří s přesností na ±0,1 °C. Vhodnými opatřeními je třeba zabránit fotolýze.

U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuštěný kyslík (např. 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem před přípravou roztoku).

VII.1.6.5 Zkušební postup

VII.1.6.5.1 Předběžná zkouška

U všech látek se provede předběžná zkouška při teplotě 50 ± 0,5°C pro tři hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je při 50 °C poločas (t½) menší než 2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 %. (Lze odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den, resp. delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu ukáže, že při 50 °C dojde při všech třech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkušební látky, nebo že po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10% zkušební látky, nejsou další experimenty nezbytné.

V ostatních případech a pro hodnoty pH, u nichž výše uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouška 1.

VII.1.6.5.2 Zkouška 1

Zkouška 1 se provede při jedné teplotě, nejlépe při 50 ± 0,5 °C, a pokud možno za sterilních podmínek při pH, pro něž se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek.

Zvolí se dostatečný počet vzorků, aby byl pokryt stupeň hydrolýzy 20 až 70 % a bylo tak možné ověřit, že jde při specifikovaném pH o reakci pseudoprvního řádu.

Pro každé pH, při němž se zkouška 1 provede, se stanoví řád reakce.

Odhad rychlostní konstanty při 25 °C:

Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkoušky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, či nikoliv.

Pokud nelze ze zkoušky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky 2.

Vyplývá-li s jistotou ze zkoušky 1, že jde o rekci pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím výsledků zkoušky 1, viz bod 3.2).

VII.1.6.5.3 Zkouška 2

Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to

buď při teplotě nižší než 40 °C,

nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 2, se v přiměřených intervalech zvolí nejméně 6 bodů tak, že stupeň hydrolýzy je v oblasti 20 až 70 %.

Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měření dvakrát. Pokud se zkouška 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, provede se měření dvakrát nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.

Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se provede zkouška 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t½).

VII.1.6.5.4 Zkouška 3

Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to

buď při teplotě nižší než 40 °C,

nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.

Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 3, se zvolí tři body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; vypočte se konstanta kpozorov. a poločas t½.

VII.2 DATA

Jde-li o reakci pseudoprvního řádu, lze vypočítat hodnoty konstanty kpozorov. pro každé pH a každou zkušební teplotu z grafu závislosti hodnot logaritmů koncentrací na čase pomocí rovnice:

kpozorov. = - směrnice × 2,303 (7)

Dále je možné z rovnice (6) vypočítat t½.

Podle potřeby se s použitím Arrheniovy rovnice stanoví k25 °C.

Pokud chování neodpovídá reakci pseudoprvního řádu, viz bod 3.1.

VII.3 ZPRÁVA

VII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:

specifikaci látky;

všechny výsledky získané s referenčními látkami;

podstatu a podrobnosti použité analytické metody;

pro každou zkoušku; teplotu, pH, složení pufračního roztoku, tabulku se všemi údaji o koncentraci a čase;

u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty kpozorov. a t½, včetně metody jejich výpočtu;

u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, graf průběhu závislosti. logaritmu koncentrace na čase;

všechny informace a pozorování nezbytné pro interpretaci výsledků.

VII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 °C) zkušebních látek za předpokladu, že pro homology chemické látky již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že lze důvodně očekávat, že aktivační energie zkušební látky je stejného řádu.

VII.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.

(2) W. Mabey, T. Mill.: Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions. J. Phys, Chem. Ref. Data, 1978, 7 (2), 383-415.


DODATEK

Pufrační roztoky

A. CLARK A LUBS

Hodnoty pH uvedené v následujících tabulkách byly vypočteny na základě měření potenciálu za použití Sörensenových standardních rovnic. Skutečné hodnoty pH jsou o 0,04 vyšší než hodnoty v tabulce.

SloženípH
kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1) při 20 °C
2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml3,8
kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml4,0
3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml4,2
dihydrogenfosforečnan draselný (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml6,8
29,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml7,0
35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml7,2
H3BO3 (0,1 mol·l-1) v KCl (0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 20 °C
16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml8,8
21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml9,0
26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml9,2

B. KOLTHOFF A VLEESHOUWER

SloženípH
Monokalium-citrát(0,1 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1) při 18 °C
(je třeba přidat malý krystalek thymolu, aby nevznikaly plísně)
2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml3,8
9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml4,0
16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml4,2

C. SÖRENSEN

Borax (0,05 mol·l-1) a HCl (0,1 mol·l-1)

SloženípH
ml boraxuml HClSörensen
18 °C
Walbum
10 °C40 °C70 °C
8,02,08,918,968,778,59
8,51,59,019,068,868,67
9,01,09,099,148,948,74
9,50,59,179,229,018,80
10,00,09,249309,088,86

Borax (0,05 mol·l-1) a NaOH (0,1 mol·l-1)

SloženípH
ml boraxuml HClSörensen
18 °C
Walbum
10 °C40 °C70 °C
10,00,09,249,309,088,86
9,01,09,369,429,188,94
8,02,09,509,579,309,02
7,03,09,689,769,449,12

VIII. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO ŽÍŽALY - ZKOUŠKA NA UMĚLÉ PŮDĚ - metoda C.8 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

VIII.1 METODA

VIII.1.1 ÚVOD

V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka přidá do umělé půdy, do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této době (a nepovinně i po sedmi dnech) se vyšetří letální účinek látky na žížaly. Zkouška je metodou relativně krátkodobého orientačního zjištění účinku chemických látek na žížaly při dermálním a potravním příjmu.

VIII.1.2 JEDNOTKY A DEFINICE

LC50: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, při které v průběhu zkoušky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvířat.

VIII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKA

Referenční látka se používá periodicky jako prostředek pro důkaz, že se citlivost zkušebního systému podstatně nezměnila.

Jako referenční látka se doporučuje chloracetamid analytické čistoty.

VIII.1.4 PRINCIP ZKOUŠKY

Půda představuje proměnlivé prostředí, takže se pro zkoušku používá pečlivě definovaná umělá hlinitá půda. V definované umělé půdě se chovají dospělé žížaly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) a exponují se různým koncentracím zkoušené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinně i 7 dní) po začátku zkušky rozprostře na podložku a spočítají se žížaly, které při jednotlivých koncentracích přežijí.

VIII.1.5 KRITÉRIA KVALITY

Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelnější. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 %, jinak je zkouška neplatná.

VIII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

VIII.1.6.1 Látky

VIII.1.6.1.1 Substrát pro zkoušku

Jako základní substrát pro zkoušku se používá definovaná umělá půda.

(a) Základní substrát (procenta se rozumí na bázi suché hmotnosti):

- 10 % sfagnové rašeliny (s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mleté),

- 20 % kaolinitického jílu, pokud možno s více než 50 % kaolinitu,

- asi 69 % průmyslového křemenného písku (dominantní jemný písek s více než 50 % částic velikosti 0,05 až 0,2 mm). Pokud zkoušená látka není dostatečně dispergovatelná ve vodě, je třeba ponechat k dispozici pro pozdější míšení se zkoušenou látkou 10 g na každou zkušební nádobu,

- asi 1 % uhličitanu vápenatého (CaCO3), práškového, chemicky čistého, přidaného pro úpravu pH na 6,0 ± 0,5.

(b) Substrát pro zkoušku:

Substrát pro zkoušku obsahuje základní substrát, zkoušenou látku a deionizovanou vodu.

Obsah vody činí asi 25 až 42 % sušiny základního substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysušením vzorku na konstantní hmotnost při 105 °C. Klíčovým kritériem je, že mělá půda musí být vlhčena tak, aby neobsahovala stojící vodu. Je třeba věnovat péči mísení, aby se dosáhlo rovnoměrného rozdělení zkoušené látky a substrátu, působ uvedení zkoušené látky do substrátu je třeba uvést ve zprávě.

(c) Kontrolní substrát:

Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. Přidává-li se aditivní činidlo, musí další kontrola obsahovat stejné množství aditivního činidla.

VIII.1.6.1.2 Nádoby pro zkoušku

Skleněné nádoby o obsahu asi jednoho litru (řádně přikryté plastovými víky, miskami nebo plastovou fólií s otvory pro větrání), naplněné množstvím vlhkého substrátu pro zkoušku nebo kontrolního substrátu, ekvivalentním 500 g suchého substrátu.

VIII. 1.6.2 Experimentální podmínky

Nádoby je třeba uchovávat v klimatizovaných komorách při 20 ± 2 °C se stálým světlem. Intenzita světla by měla být 400 až 800 lux.

Doba trvání zkoušky je 14 dní, ale je možné nepovinně vyhodnotit úhyn sedm dní po začátku zkoušky.

VIII.1.6.3 Pracovní postup

Zkoušené koncentrace

Koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost látky na hmotnost sušiny základního substrátu (mg.kg-1).

Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací

Aby se získaly informace o vhodném rozmezí koncentrací pro definitivní zkoušku provede se předběžná zkouška, kterou se zjistí rozsah koncentrací, které právě způsobují úhyn od 0 do 100 %.

Látku je třeba zkoušet při těchto koncentracích: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg látky.kg-1 substrátu pro zkoušku (jako sušina).

Je-li třeba provést úplnou definitivní zkoušku, stačí pro zkoušku pro zjištění rozsahu koncentrací jedna zkušební skupina na každou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu, každá o 10 žížalách.

Definitivní zkouška

Výsledky zkoušky pro zjištění rozsahu koncentrací se použijí pro volbu nejméně pěti koncentrací, odstupňovaných v geometrické posloupnosti, právě pokrývajících rozsah 0 až 100 % mortality, lišících se o konstantní činitel nepřevyšující 1,8.

Zkoušky používající tyto řady koncentrací musí umožnit co nejpřesnější stanovení hodnoty LC50 a jejích mezí spolehlivosti.

V definitivní zkoušce se používají nejméně čtyři zkušební skupiny na každou koncentraci a čtyři neexponované kontrolní skupiny, každá o 10 žížalách. Výledky za tyto replikované skupiny se uvedou průměrem a standardní odchylkou.

Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 , jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci oblasti, do které spadá LC50.

Mísení základního substrátu a zkoušené látky

Substrát pro zkoušení musí být všude tam kde je to možné připraven bez jakýchkoli přídavných činidel jiných než voda. Těsně před začátkem zkoušky se smísí emulze nebo disperze zkoušené látky v deionizované vodě nebo v jiném rozpouštědle se základním substrátem pro zkoušení, nebo se na něj rovnoměrně rozstříká rozprašovačem pro chromatografii nebo podobným rozprašovačem.

Je-li zkoušená látka nerozpustná ve vodě, může se rozpustit v co nejmenším objemu vhodného organického rozpouštědla (např. hexanu, acetonu nebo chloroformu).

K rozpuštění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené látky lze použít pouze činidla, která snadno těkají. Substrát pro zkoušení je nutné před použitím odvětrat. Množství odpařené vody je nutné nahradit. Kontrolní zkouška musí obsahovat stejné množství všech aditivních činidel.

Není-li zkoušená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná

v organických rozpouštědlech, připraví se směs 10 g křemenného písku a množství zkoušené látky potřebné pro přípravu 500 g zkušebního substrátu a ta se smíchá se 490 g zvlhčeného základního substrátu (hmotnost se rozumí v sušině).

Pro každou jednotlivou vsázku použitou ve zkoušce se do skleněné nádoby vpraví množství vlhkého substrátu pro zkoušku, ekvivalentní 500 g sušiny, a na povrch substrátu se umístí 10 žížal, které byly před použitím kondicionovány po 24 hodiny v podobném vlhkém základním substrátu, poté rychle omyty a zbaveny přebytečné vody absorpcí filtračním papírem.

Nádoby se přikryjí plastovými víky s otvory, miskami nebo fólií, aby se zabránilo vysychání substrátu, a udržují se v podmínkách zkoušky po 14 dní.

Vyhodnocení je třeba provést 14 dní (a nepovinně i sedm dní) po zahájení zkoušky. Substrát se rozprostře na podnos ze skla nebo nerezové oceli. Žížaly se vyšetří a stanoví se počet přežívajících jedinců. Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické podráždění na předním konci.

Provádí-li se vyšetření po sedmi dnech, nádoba se znovu naplní substrátem a žížaly se znovu vloží na povrch téhož substrátu.

VIII.1.6.4 Organizmy použité ve zkoušce

Ke zkoušce musí být použity dospělé žížaly Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) (alespoň dva měsíce staré s klitellem) o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až 600 mg. (Pokud se týká metody chovu, viz příloha.)

VIII.2 VÝSLEDKY

VIII.2.1 ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

Uvedou se koncentrace zkoušené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žížal.

Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC50 se udává v mg zkoušené lát ky na 1 kg substrátu pro zkoušku (v sušině).

V případech, kdy sklon křivky koncentrací je pro vý počet LC50 příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.

Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC50.

VIII.3 ZPRÁVA

VIII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace:

- prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvedenými kritérii kvality,

- o druhu provedené zkoušky (zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouška),

- přesný popis experimentálních podmínek nebo konstatování, že zkouška byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veškeré odchylky,

- přesný popis, jak byla zkoušená látka smísena se základním substrátem,

- informace o organismech použitých ve zkoušce (druh, stáří, střední hmotnost a rozsah jednotlivých hodnot, podmínky chovu, dodavatel),

- metoda použitá ke stanovení LC50,

- výsledky zkoušky včetně všech použitých údajů,

- popis pozorovaných symptomů nebo změn v chování organizmů použitých ve zkoušce,

- úhyn v kontrolních zkouškách,

- LC50 nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvolávající úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinně sedm dní) od začátku zkoušky,

- grafické znázornění křivky koncentrace/odezva,

- výsledky získané s referenční látkou, ať v souvislosti s touto zkouškou nebo dřívějších zkoušek kontroly jakosti.

VIII.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.

(2) Edwards, C.A. a Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and all, London.

(3)Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Écolo gieet Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 str.

(4) Litchfield, J.T., Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99

(5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfäh rensvorschlag “Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden“, in Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

* S roztoky obsahujícími rtuť se po použití nakládá tak, aby nedošlo k průniku rtuti do životního prostředí.

PŘÍLOHA

Chov žížal před zkouškou

Pro účely chovu se 30 až 50 dospělých žížal umístí do chovné schránky s čerstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je možné použít pro další chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotků se použijí ke zkoušení, když jsou dospělé (v uvedených podmínkách po dvou až třech měsících).

Podmínky chovu

Klimatizovaná komora: teplota 20 ± 2 °C, nejlépe s neustálým světlem (intenzita 400 - 800 lux).

Chovné nádoby: vhodné mělké nádoby o objemu 10 až 20 l.

Substrát: Eisenia foetida je možné chovat v různých zvířecích exkrementech. Jako chovné médium se doporučuje používat směs 50 % obj. rašeliny a 50 % obj.hovězího nebo koňského hnoje. Médium musí mít pH asi 6 až 7 (upraví se uhličitanem vápenatým) a nízkou iontovou vodivost (méně než 6 mmhos nebo 0,5 % koncentraci solí).

Substrát musí být vlhký, ale ne příliš mokrý.

Vedle výše uvedené metody je možné používat i jiné úspěšné postupy.

Poznámka:

Eisenia foetida existuje ve dvou odrůdách, které někteří taxonomové rozlišili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avšak jedna, Eisenia foetida foetida, má na článcích typické příčné pruhování nebo páskování a druhá, Eisenia foetida andrei, toto postrádá a má pestře červené zbarvení. Pokud je to možné, je třeba používat Eisenia foetida andrei. Jiné druhy je možné použít, pokud existuje potřebná metodika.

IX. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI - ZAHN-WELLENSOVA ZKOUŠKA - metoda C.9 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IX.1 METODA

IX.1.1 ÚVOD

Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.

Při interpretaci. výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.

Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.

Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.

Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této metodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.

Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:

jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,

mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,

neinhibují bakterie,

jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,

pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.

Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.

Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.

IX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:

CT − CB
DT (%) = [ 1 − ———— ] · 100
CA − CBA

kde:

DT = rozklad (%) v čase T,

Ca = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1),

CT = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l-1),

CB = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku, (mg.l-1),

CBA = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l-1).

Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.

Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.

Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).

IX.1.3 STANDARDNÍ LÁTKY

Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.

IX.1.4 PRINCIP METODY

Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 ° C

v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.

V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.

IX.1.5 KRITÉRIA KVALITY

Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.

Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.

IX.1.6 POSTUP ZKOUŠENÍ

IX.1.6.1 Příprava

IX.1.6.1.1 Reagencie

Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menším než 5 mg.l-1.Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7 mmol.l-1, jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionizovanou nebo destilovanou vodu.

Kyselina sírová p. a. 50 g.l-1

Hydroxid sodný p.a. 40 g.l-1

Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí:

Chlorid amonný NH4Cl p.a. 38,5 g

NaH2PO4 . 2H2O p.a. 33,4 g

KH2PO4 p.a. 8,5 g

K2HPO4 p.a. 21,75 g

Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH.

IX.1.6.1.2 Přístroje

Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.

Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.

Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.

Odstředivka (cca 3 550 g).

pH-metr.

Oximetr.

Papírový filtr.

Membránový filtrační přístroj.

Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.

Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.

IX.1.6.1.3 Příprava inokula

Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.

Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.).

Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.

IX.1.6.1.4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky

Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l-1 minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l-1 sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l-1

suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup.

Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérii nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.

IX.1.6.2 Pracovní postup

Kultivační nádoby se inkubují při difusním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 °C, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba se provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l-1.

V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.

Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovanou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.

Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK

v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní.

Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.

Funkční kontrola aktivovaného kalu

Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.

Adaptace

V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužen až do konečného rozložení zkoušené látky.

Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem:

Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.

Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.

Příprava pro analýzu

Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).

Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 μm).

Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC . Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován

v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.

CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.

IX.2 VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY

Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypočítá podle vzorce 1. 2 a její hodnota se zaokrouhluje ha celá procenta. Takt stanovená rozložitelnost se označuje jako „Biologická rozložitelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuškou“.

Poznámka: Jestliže je dosaženo úplného rozložení zkoušené látky před řádným proběhnutím zkoušky a výsledek je potvrzen další analýzou provedenou následující den, může být zkouška ukončena.

IX.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

IX.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE

V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:

počáteční koncentrace látky,

všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),

koncentrace látky po 3 h,

inhibiční křivka s popisem,

datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd., — vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.

IX.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána.

V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.

Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.

Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.

Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná.

Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zákalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.

Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených 14C. Jestliže je použita zkoušená látka s 14C, je možné stanovením 14CO2 prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.

Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky.

Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.

IX.4 LITERATURA

(1) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final

(2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984).

PŘÍLOHA

PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ

Organická látka: 4 - ethoxybenzoová kyselina

Teoretická koncentrace ve zkoušce: 600 mg.l-1

Teoretická DOC : 390 mg.l-1

Inokulum: městská čistírna v......

Koncentrace: 1 g sušiny.l-1

Adaptace: bez adaptace

Analytika: stanovení DOC

Množství vzorku: 3 ml

Referenční látka: diethylenglykol

Toxicita zkoušené látky: žádné toxické účinky při koncentraci menší než 1000 mg.l-1

Použitá zkouška: zkouška ve fermentačních trubicích

Doba
zkoušky
Referenční látkaZkoušená látka
sl. p.
mg.l-1
DOC
mg.l-1
DOCn
mg.l-1
Rozklad
%
DOC
mg-l-1
DOCn
mg.l-1
Rozklad
%
0--300--390-
3 h4,0298,0294,02371,6367,66
1 den6,1288,3282,36373,3367,26
2 dny5,0281,2276,28360,0355,09
5 dnů6,3270,5264,212193,8187,552
6 dnů7,4253,3245,918143,9136,565
7 dnů11,3212,5201,233104,593,276
8 dnů7,8142,5134,75558,951,187
9 dnů7,035,028,09118,111,197
10 dnů18,037,019,09420,02,099

Poznámka: DOC stanovena v triplikátech.

sl. p. = slepý pokus

Obrázek 1

Příklad křivek biologického rozkladu

Příklad křivek biologického rozkladu

Obrázek 2

Příklad adaptace kalu

Příklad adaptace kalu

X. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI -SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM - metoda C.10 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

X.1 METODA

X.1.1 ÚVOD

X.1.1.1 Obecné poznámky

Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:

jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,

mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,

neinhibují bakterie.

Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.

X.1.1.2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)

Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.l-1 (nebo CHSK cca 40 mg.l-1) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg/l.

Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.

X.1.1.3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)

Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky . (vymizení původní „rodičovské“ chemické struktury).

Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.

Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.

X.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

X.1.2.1 Analýza DOC/CHSK

Úbytek látky je vyjádřen vztahem:

T − (E − Eo)
DR = ————— · 100% (1a)
T
DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané střední době prodlení,
T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l-1 DOC nebo CHSK,
E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l-1,
Eo = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l-1.

Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.

X.1.2.2 Specifická analýza

Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) během udaného času prodlení:

C1 − C0
Rw = ———— · 100% (1b)
C1

C1 = koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou,

C0 = koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou.

X.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.

X.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD

Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.

Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.

DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje.

Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.

Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).

Obě zařízení mohou být provozována jako „spřažená“ pomocí postupu vzájemné inokulace.

X.1.5 KRITÉRIA KVALITY

Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.

X.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

X.1.6.1 Příprava

X.1.6.1.1 Přístroje

Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:

Potvrzující zkouška OECD

Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).

Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 1. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém Zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 1. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.

Zařízení s porézní nádobkou

Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tloušťka 2 mm, maximální velikost pórů 95 mikronů) stočené do válce o průměru 14 cm s konickým dnem 45 °, obrázky 1 a 2 v příloze 2. Porézní nádobka je umístěna v nepropustné nádobě o průměru 15 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou částí odtok ve výšce 17,2 cm, čímž je

v zařízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitřní nádoby je upevněn kruhový držák tak, že mezi vnější a vnitřní nádobou je 0,5 cm odtoková mezera.

Celé zařízení je umístěno do vodní lázně regulované termostatem. Vzduch je přiváděn na dno vnitřní nádoby pomocí vhodného rozvaděče.

Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně 24 l. Čerpadlo (B) umožňuje konstantní přítok odpadních vod do aerační nádoby. Může být použit jakýkoliv vhodný systém za předpokladu, že zaručuje stanovený přítok a koncentraci.

K dispozici musí být zásoba dalších porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se čistí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou.

X.1.6.1.2 Filtrace

Používají se membránové filtrační přístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 μm). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkoušenou látku při filtraci.

X.1.6.1.3 Odpadní voda

Může být použito buď vhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda.

Příklad syntetického média:

V 1 l pitné vody se rozpustí:

pepton160 mg,
masový extrakt110 mg,
močovina30 mg,
NaCl7 mg,
CaCl2 . 2 H2O4 mg,
MgSO4 . 7 H2O2 mg,
K2HPO428 mg.

Komunální odpadní vody:

Odebírají se čerstvé každý den z přepadu mechanického stupně čistírny, která čistí převážně městské odpadní vody.

X.1.6.1.4 Zásobní roztok zkoušeně látky

Připraví se např. 1% roztok zkoušené látky, který se bude přidávat do zkušební jednotky. Stanoví se koncentrace zkoušené látky a určí se příslušný objem zásobního roztoku, který je potřebné přidat k odpadní vodě nebo dalším čerpadlem přímo do zkušební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkušební koncentrace.

X.1.6.1.5 Inokulum

Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se používat aktivovaný kal.

Mohou se používat inokula z různých zdrojů.

Příklady vhodného inokula:

a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod

Inokulum může být získáno z odtoku dobře fungující čistírny zpracovávající převážně komunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v době mezi odběrem a použitím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se připraví filtrací vzorku vody přes hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito ve stejný den kdy bylo připraveno. K inokulaci se užívá nejméně 3 ml.

b) Směsné inokulum

Inokulum odebrané z odtoku čistírny:

Viz předchozí popis.

Inokulum z půdy:

100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v 1 l nechlorované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minu dekantovat. Kapalná fáze se přefiltruje, prvních 200 ml se vylije. Filtrát se ihned provzdušňuje až do okamžiku použití. Inokulum je možné použít pouze ten den, kdy bylo připraveno.

Inokulum z povrchové vody:

Další díl směsného inokula se získává z mesosaprobních povrchovým vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát udržuje v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito pouze ten den, kdy bylo připraveno.

Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílů všech tří dílčích inokulí. K očkování se používají nejméně 3 ml směsného roztoku.

c) Inokulum z aktivovaného kalu

Používá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných částic do 2,5 g/l) odebraný z aerační nádrže čistírny komunálních odpadních vod.

X.1.6.2 Postup

Zkouška se provádí při laboratorní teplotě, která se má udržovat mezi 18 - 25 °C.

Zkouška může být event. prováděna při nižších teplotách (do 10 ° C). Pokud se zkoušená látka za těchto podmínek rozkládá, nejsou zapotřebí žádná další měření. Jestliže však při nižší teplotě rozkládána není, musí být zkouška opakována při teplotě 18 - 25 °C.

X.1.6.2.1 Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu

Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkušební jednotky

Rozběhová fáze začíná první vsádkou zkoušené látky a končí dobou, kdy naměřený úbytek zkoušené látky dosáhne relativně konstantní hodnoty. Tato fáze by neměl trvat déle než 6 týdnů.

Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamžiku kdy úbytek zkoušené látky dosáhl relativně konstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se během šest týdnů trvající rozběhové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalších tří následujících týdnů.

Na začátku zkoušky se zkušební jednotka(y) naplní zkušební kapalinou s inokulem.

Zapne se provzdušňování a mamutka (při použití zkušebního zařízení podle OECD) a zapne se dávkovací zařízení.

Přítok odpadních vod bez zkoušené látky do aerační nádoby se udržuje na rychlosti 1 l.h-1 nebo 1/2 l.h-1; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h.

Intenzita provzdušňování musí být regulována tak, aby se udržoval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuštěného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l-1.

Pěnění směsi se zabraňuje vhodnými prostředky, které neinhibují kal.

Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkoušky OECD na dně sedimentační nádoby a v cirkulačním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setřením nebo jiným vhodným způsobem.

Jestliže kal špatně sedimentuje lze zvýšit jeho hustotu přídavkem 2 ml 5%

roztoku chloridu železitého. Přídavek je možné opakovat podle potřeby.

Spřažená zařízení

Zařízení jsou spřažena tak, že je mezi nimi 1x denně vyměňováno 1,5 l suspenze (včetně kalu) z aeračních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkoušené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentační nádoby a přidává se do aerační nádoby druhého zařízení.

X.1.6.2.3 Analytika

Ke sledování chování zkoušené látky se používají dvě metody stanovení:

DOC a CHSK.

Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2).

Specifická analýza

Koncentrace zkoušené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvlášť množství látky adsorbované na aktivovaný kal.

X.2 DATA A VYHODNOCENÍ

X.2.1 SPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ

Pokud je používáno spřažené zařízení, počítá se denně stupeň odstranění, DR, postupem podle 1. 2. 1.

Tyto denní hodnoty se opraví na hodnotu Drc, zohledněním přenosu materiálu při očkování. Tento výpočet se provádí dle rovnice (2) pro střední dobu prodlení 3 hodiny a podle rovnice (3) pro střední dobu prodlení 6 hodin.

8100
DRc =DR − —— (2)
77
4100
DRc =DR − —— (3)
33

Ze získaných hodnot se vypočítá jejich průměr a dále standardní odchylka podle rovnice (4)

vzorec 022

kde:

sDRc = standardní odchylka,

vzorec 023 = průměr hodnot DRc,

n = počet stanovení.

Odlehlé hodnoty DRc se eliminují vhodnou statistickou metodou, např. Nalimovou metodou (6) pro 95% hladinu významnosti, průměr a standardní odchylka se potom vypočtou s vyloučením odlehlých hodnot Drc:

Výsledek se vyjádří dle (5) :

vzorec 024

kde

tn-1; α = tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou mez spolehlivosti P(P=1-α), kde P = 95% (1).

Výsledkem je průměr s udanými mezemi tolerance pro 95% hladinou významnosti případně s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DRc bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

Např.

DRc = 98,6 ± 2,3% úbytku DOC,

s = 4,65% úbytku DOC,

n = 18,

x = počet odlehlých hodnot.

X.2.2 NESPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ

Provozní výkon zařízení může být ověřen následovně:

% odstranění CHSK nebo DOC =

CHSK nebo DOC odp.vody − CHSK nebo DOC výtoku
= —————————————————————— . 100
CHSK nebo DOC odp.vody

Vynášením denně naměřených úbytků do grafu se zdůrazní všechny trendy, např. adaptace.

X.2.2.1 Využití stanovení CHSK/DOC

Z denně naměřených hodnot se podle kap. 1.2.1 vypočítá procentuální úbytek DR.

Z řady hodnot DR se spočítá jejich průměr a podle rovnice (6) standardní odchylka:

vzorec 025

kde

sDR = standardní odchylka hodnot Dri,

vzorec 023 = průměr hodnot Dri,

n = počet stanovení.

Odlehlé hodnoty DR se eliminují vhodnou statistickou metodou např. podle Nalimova (6) při. 95% hladině významnosti, střední hodnota a standardní odchylka jsou potom znovu vypočítány s vyloučením odlehlých hodnot DR.

Výsledná hodnota se počítá dle rovnice (7)

vzorec 026

kde

tn-1; α - tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou n mez spolehlivosti P (P=1-α), kde P = 95 % (l).

Výsledkem je průměr s mezemi tolerance při 95% hladině významnosti s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DR bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

Např.:

Dr = (98,6 ± 2,3%) úbytku DOC,

s = 4,65% úbytku DOC,

n = 18,

x = počet odlehlých hodnot.

X.2.2.2 Použití výsledků specifické analýzy

Odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) v % se počítá podle 1. 2. 2.

X.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

X.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE

V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny pokud je to možné následující údaje:

provozní podmínky, které jsou zaznamenány do formuláře uvedeného v příloze č. 3 této metody;

druh použitého zkušebního zařízení (zařízení pro průkaznou zkoušku OECD nebo zařízení s porézní nádobkou);

způsob provozování zařízení: spřažená nebo nespřažená zařízení;

druh odpadních vod: syntetické nebo komunální odpadní vody, u komunálních odpadních vod datum a místo odběru;

druh inokula, datum a místo odběru;

popis použitých analytických metod, pokud byly prováděny specifické analýzy;

grafické vyjádření závislosti úbytku CHSK nebo DOC na čase ve fázi rozběhové a vyhodnocovací;

výsledek stanovení obsahu zkoušené látky prostřednictvím CHSK nebo DOC v zásobním roztoku;

při provádění specifické analýzy: grafické vyjádření procentuálního úbytku zkoušené látky z kapalné fáze během rozběhové a vyhodnocovací fáze v závislosti na čase;

střední úbytek DOC nebo CHSK zkoušené látky a standardní odchylka výsledků získaných během vyhodnocovací fáze, kdy úbytek zkoušené látky je konstantní;

grafické vyjádření koncentrace aktivovaného kalu v závislosti na čase;

poznámky týkající se aktivovaného kalu (odstraňování přebytečného kalu ze zařízení, tvorba shluků, použití chloridu železitého atd.);

proměřované koncentrace zkoušené látky;

výsledky analýz kalu;

všechny informace o zkoušené látce a o referenční látce, pokud byla použita;

vědecké zdůvodnění všech odchylek a změn metody.

X.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Příčinou nízké hodnoty úbytku zkoušené látky z vodné fáze může být inhibice mikroorganismů způsobená touto látkou. Projevuje se to především rozpouštěním a ztrátou kalu, zakalováním kapalné fáze a snížením účinnosti odstraňování CHSK nebo DOC v zařízení.

Někdy hraje roli fyzikálně-chemická adsorbce. Vztah mezi biologickým působením na látku a její fyzikálně-chemickou adsorpcí je možné rozlišit po odpovídající desorpci.

K rozlišení úplného nebo částečného biologického rozkladu od adsorbce je nutno provést další zkoušky.

Nabízí se zde více možností. Nejlepším postupem je použití kapalné fáze ze sedimentační nádoby jako inokula v některé ze zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce).

Vysoké hodnoty úbytku DOC nebo CHSK jsou zpravidla způsobovány biologickým rozkladem, nízké hodnoty úbytku naproti tomu nelze odlišit od jiných mechanizmů odstranění látky. Pokud např. rozpustná sloučenina vykazuje stupeň adsorbce 98 % a denně je odstraňováno 10 % kalu, dochází až ke 40 % odstranění látky v tomto kalu. Je-li denně odstraňováno 30 % kalu, může eliminace na základě adsorbce a odstranění kalu stoupnout na 65 % (4):

Při používání specifických analýz je třeba brát na zřetel vliv struktury látky na specifickou analýzu. Úbytek látky stanovený specifickou analýzou nemůže být interpretován jako mineralizace látky.

X.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C (81) 30 final.

(2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC,Official Journal of the European Communities, No L 251,19. 9. 1984).

(3) H. A. Painter and E. F. King, WRC Porous Pot method for asessing biodegradability. Technical report TR70. June 1978, Water Research Center, Velká Británie.

(4) Wierich P. and Gerike P., The Fate of Soluble, Recalcitrant, and Absorging Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Enviromental Safety, Vol 5, Nr. 2 - June 1981, str. 161 - 171.

(5) Council Directives 82/242/EEC und 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 73/404/EEC und 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L347, 17. 12. 1973.

(6) Streuli, H., Fehlerhafte. Interpretation und Anwendung von Ausreissetest, insbesondere bei Rindversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fressenius-Zeitschrift fur Analytische Chemie (1980), str. 406 - 408.

PŘÍLOHA 1

Obrázek 1

Obrázek 1

A = zásobník

B = dávkovací zařízení

C = aerační komora (objem 3 litry)

D = sedimentační nádoba

E = mamutka

F = zásobník na výtok

G = aerátor

H = průtokoměr (nepovinně)

Obrázek 2

Obrázek 2

PŘÍLOHA 2

Obrázek 1

Zařízení používané pro stanovení biologické rozložitelnosti

Zařízení používané pro stanovení biologické rozložitelnosti

A = zásobník

B = dávkovací čerpadlo

C = porézní aerační nádobka

D = vnější nepropustná nádoba

E = zásobník na výtok

F = vzduchovací kámen

G - rotametr

Obrázek 2

Detaily třílitrové vzduchovací porézní nádobky

Detaily třílitrové vzduchovací porézní nádobky

PŘÍLOHA 3

Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

Označ v každé skupině

XI. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI - ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU - metoda C.11 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

XI.1 METODA

XI.1.1 ÚVOD

Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mikroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.

Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.

Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.

Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.

Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.

U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC50.

Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,

Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:

rozpustnost ve vodě,

tlak par,

strukturní vzorec,

čistota zkoušené látky.

Doporučení:

Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.

XI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O2 na 1 mg kalu za hodinu.

Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:

2Rs
(1 − ———— ) · 100 = % inhibice
Rc1 + Rc2

kde:

Rs = rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky,

Rc1 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 1,

Rc2 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 2.

EC50 v této zkoušce je koncentrace zkoušené látky, při které respirační rychlost činí 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkoušky za podmínek popsaných v této metodě.

XI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

Jako referenční látku se doporučuje používat známý inhibitor dýchání 3,5-dichlorfenol. Ověřením EC50 u každé dávky aktivovaného kalu by mělo být zkontrolováno, že kal není abnormálně citlivý.

XI.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyživovaného standardním množstvím syntetické odpadní vody se měří po době kontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou časech. Měří se také rychlost dýchání téhož aktivovaného kalu v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkoušené látky při určité koncentraci se vyjadřuje jako procento průměrné rychlosti dýchání že dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC50 se vypočítá ze stanovení při různých koncentracích.

XI.1.5 KRITÉRIA KVALITY

Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže:

respirační rychlosti dvou kontrolních pokusů se od sebe liší nejvýše o 15 %,

EC50 (pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5-dichlorfenolu leží v přijatém rozmezí 5 - 30 mg.l-1.

XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XI.1.6.1 Činidla

XI.1.6.1.1 Roztoky zkoušené látky

Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l-1.

XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky

Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H2SO4 do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H2SO4) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.

XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda

Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:

16 g peptonu,

11 g masového extraktu,

3 g močoviny,

0,7 g NaCl,

0,4 g CaCl2.2H2O,

0,2 g MgSO4.7H2O,

2,8 g K2HPO4.

Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD “Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech“ (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.

Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat

v temnu při 0 - 4 °C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.

XI.1.6.2 Aparatura

Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.

Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto:

měřicí přístroje,

provzdušňovací zařízení,

měřič pH a monitorovací zařízení,

kyslíková elektroda.

XI.1.6.3 Příprava inokula

Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.

Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.

Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).

Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal

v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l-1. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l-1.

Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, připraveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 ± 2 °C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.

Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.

XI. 1.6.4 Provedení zkoušky

Trvání/doba kontaktu: 30 minut a (nebo) 3 hodiny, během kterých probíhá provzdušňování

Voda: Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)

Přívod vzduchu: Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1.

Měřicí aparatura: Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK.

Měřič obsahu kyslíku: Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem.

Živný roztok: Syntetická odpadní voda (viz výše).

Zkoušená látka: Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky.

Referenční látka: např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace)

Kontrolní zkouška: Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky

Teplota: 20 ± 2 °C

Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:

Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).

Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.

V okamžiku “0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C1).

Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l-1 a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l-1.

V okamžiku “15 minut“ (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15-minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.

Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.

Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.

Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.

Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).

Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).

XI.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

Rychlost dýchání se vypočítá ze záznamu zapisovače mezi přibližně 6,5 mg.l-1 a 2,5 mg.l-1, nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační křivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární.

Jestliže rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech neleží v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC50 (za 30 minut nebo tři hodiny) referenční látky neleží v akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l-1 pro 3,5-dichlorfenol), je zkouška neplatná a musí se opakovat.

Pro každou zkušenou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmicko-pravděpodobnostním) papíru a odečte se hodnota EC50.

Standardními postupy je možné stanovit pro hodnoty EC50 95% meze spolehlivosti.

XI.3 ZPRÁVA

XI.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:

zkoušená látka: chemické identifikační údaje,

systém použitý při zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá předběžná úprava aktivovaného kalu,

experimentální podmínky:

- pH reakční směsi před měřením respirace,

- teplota při zkoušce,

- ba trvání zkoušky,

- referenční látka a její změřená EC50,

- abiotická spotřeba kyslíku (pokud k ní dochází).

výsledky:

- veškeré naměřené hodnoty,

- křivka inhibice a metoda výpočtu EC50,

- EC50 a je-li možné 95% meze spolehlivosti, EC20 a EC80,

- veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební metody, které mohly ovlivnit výsledek.

XI.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Hodnotu EC50 je třeba považovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkoušené látky buď při zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze přesně simulovat laboratorní zkouškou. Mimoto, zkoušené látky, které mohou mít inhibiční účinky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibiční křivky. Proto je nutné interpretovat tyto křivky opatrně.

XI.4 LITERATURA

(1) International Standard ISO 8192-1986.

(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165

(3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245

(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association ofDyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv), Recommended Method No 103, také popsáno v:

(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80

(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247

(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.

XII. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI -MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS - metoda C.12 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

XII.1 METODA

XII.1.1 ÚVOD

Cílem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozložitelnosti netěkavých organických látek rozpustných ve vodě, jsou-li vystavený poměrně vysokým koncentracím mikroorganizmů po dlouhé časové období. Životaschopnost mikroorganizmů se udržuje po tuto dobu denními přídavky živin z usazené odpadní vody. (Pro potřebu během víkendů lze odpadní vodu přechovávat při 4 °C. Alternativně je možné použít syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkoušky OECD.)

Při interpretaci výsledků (viz 3. 2) je nutné brát v úvahu, že může docházet k fyzikálně-chemické adsorpci na suspendovaných tuhých látkách.

V důsledku dlouhé doby zdržení kapalné fáze (36 hodin) a průběžného přidávání živin nesimuluje zkouška podmínky existující v čistírně odpadních vod. Výsledky získané při pokusech s různými látkami ukazují, že zkouška má vysoký potenciál biologického rozkladu.

Podmínky poskytované zkouškou jsou vysoce příznivé pro výběr a adaptaci mikroorganizmů schopných rozkládat zkoušenou látku. (Postup je možné použít také k získávání aklimatizovaných inokulí pro použití v jiných zkouškách.)

V této metodě se používá k hodnocení výsledné biologické rozložitelnosti zkoušené látky hodnota koncentrace rozpuštěného organického uhlíku (DOC). DOC se doporučuje raději stanovit po okyselení a přečištění než jako rozdíl Ccelk. - Canorg.

Současné použití specifické analytické metody může umožnit určení primárního rozkladu látky (úbytek výchozí chemické struktury).

Metoda je použitelná pouze pro ty organické látky, které v koncentracích používaných ve zkoušce:

jsou rozpustné ve vodě (alespoň 20 mg rozpuštěného organického uhlíku na litr),

mají zanedbatelnou tenzi par,

nepůsobí inhibičně na bakterie,

významně se neadsorbují ve zkušebním systému,

neztrácejí se ze zkoušeného roztoku pěněním.

Je nutné stanovit obsah organického uhlíku ve zkoušené látce.

Při interpretaci získaných výsledků, zejména v případech, kdy výsledky jsou nízké nebo marginální, jsou cenné informace o relativních podílech hlavních složek ve zkoušeném vzorku

Pro interpretaci nízkých výsledků a při volbě vhodné koncentrace při zkoušce mohou být užitečné informace o toxicitě látky pro mikroorganizmy.

XII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

CT = koncentrace zkoušené látky na začátku provzdušňovací periody, vyjádřená jako množství organického uhlíku přítomného nebo přidaného k usazené odpadní vodě (mg.l-1),

Ct = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou, ve zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l-1),

Cc= koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem, v kontrolní zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l-1).

Biologický rozklad je v této metodě definován jako úbytek organického uhlíku.

Biologický rozklad je možné vyjádřit jako:

1. Procentický úbytek Dda množství denně přidávané látky:

CT − (Ct − Cc)
Dda = —————— · 100 (1)
CT

kde Dds = rozklad/denní přídavek

2. Procentický úbytek Dssd množství látky přítomného na začátku každého dne:

2 CT + Cti − Cci − 3Ct(i + 1) + 3Cc(i + 1)
Dssd = ———————————————— · 100 (2(a))
CT + Cti − Cci
2 CT − 2(Ct − Cc)
= ———————— · 100 (2(b))
2 CT + (Ct − Cc)

kde Dred = rozklad/denní přídavek;

indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni měření.

Rovnice 2(a) se doporučuje, mění-li se DOC v odcházející vodě den ode dne, zatímco rovnici 2(b) lze používat, zůstává-li DOC v odcházející vodě den ode dne relativně konstantní.

XII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

XII.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

Aktivovaný kal z čistírny odpadních vod se vpraví do semikontinuální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated sludge unit). Přidají se zkoušená látka a usazená domovní odpadní voda a směs se provzdušňuje 23 hodin. Provzdušňování se pak ukončí, kal se nechá usadit a kapalina nad usazeninou se odstraní.

Kal zbylý v provzdušňovací komoře se pak smísí s další alikvotní částí zkoušené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje.

Biologický rozklad se určí stanovením obsahu rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem. Tato hodnota se porovná s hodnotou, zjištěnou pro kapalinu získanou z kontrolní nádoby, do které byla dávkována pouze usazená odpadní voda.

Použije-li se specifická analytická metoda, je možné měřit změny koncentrace výchozí chemické látky v důsledku biologického rozkladu (primární biologický rozklad).

XII.1.5 KRITÉRIA KVALITY

Reprodukovatelnost této metody, založené na úbytku rozpuštěného organického uhlíku, nebyla ještě stanovena. (Pokud se uvažuje primární biologický rozklad, dosahuje se velmi přesných hodnot pro látky, které se rozkládají ve vysokém stupni.)

Citlivost metody je ve velké míře určena variabilitou slepé zkoušky a v menší míře přesností stanovení rozpuštěného organického uhlíku a obsahem zkoušené látky v kapalině na začátku každého cyklu.

XII.1.6 POPIS PRACOVNÍHO POSTUPU

XII.1.6.1 Příprava

Sestaví se dostatečný počet čistých provzdušňovacích jednotek, alternativně je možné použít originální zkušební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, a trubic pro přívod vzduchu (obrázek 1) pro každou zkoušenou látku a pro kontrolní zkoušky. Stlačený vzduch přiváděný do zkušebních jednotek, přečištěný vatovým filtrem, musí být prostý organického uhlíku a musí být předem nasycen vodou, aby se snížily ztráty vypařováním.

Vzorek směsné kapaliny, obsahující 1 - 4 g suspendovaných tuhých látek v 1 litru, se získá z čistírny pracující s aktivovaným kalem, čistící převážně domovní odpadní vody. Pro každou provzdušňovací jednotku je třeba přibližně 150 ml směsné kapaliny.

Zásobní roztoky zkoušené látky se připravují s použitím destilované vody; normálně požadovaná koncentrace je 400 mg.l-1 jako organický uhlík, což představuje koncentraci zkoušené látky 20 mg.l-1 uhlíku na začátku každého cyklu provzdušňování, nedochází-li k biologickému rozkladu.

Dovoluje-li to toxicita pro mikroorganizmy jsou přípustné vyšší koncentrace.

Měří se obsah organického uhlíku zásobních roztoků.

XII.1.6.2 Experimentální podmínky

Zkoušku je třeba provádět při 20 - 25 °C. Používá se vysoká koncentrace aerobních mikroorganizmů (1 - 4 g.l-1 suspendovaných látek), a efektivní doba zdržení je 36 hodin. Uhlíkaté látky v přiváděné odpadní vodě se v široké míře oxidují, normálně během osmi hodin po začátku každého cyklu provzdušňování. Potom kal endogenně dýchá po zbytek provzdušňovací periody, a v této době je jediným dostupným substrátem zkoušená sloučenina, pokud se také rychle nemetabolizuje. Tyto skutečnosti spolu s denně opakovaným očkováním, používá-li se jako médium domovní odpadní voda, vytvářejí vysoce příznivé podmínky jak pro aklimatizaci, tak pro vysoký stupeň rozkladu.

XII.1.6.3 Provedení zkoušky

Získá se vzorek směsné kapaliny z vhodné čistírny čistící aktivovaným kalem převážně domovní odpadní vody nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udržuje se v aerobních podmínkách až do použití v laboratoři. Do každé aerační i kontrolní jednotky se naplní 150 ml směsné kapaliny (používá-li se originální jednotka pro zkoušku SCAS, je třeba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se provzdušňování. Po 23 hodinách se provzdušňování ukončí a kal se nechá 45 minut usadit. Postupně se otevřou kohouty všech nádob a odeberou se 100 ml podíly kapaliny nad usazeninou. Ke kalu zbylému v každé aerační jednotce se přidá 100 ml usazené domovní odpadní vody získané bezprostředně před použitím. Opět se zahájí provzdušňování. V. této etapě se nepřidávají žádné zkoušené látky, a do jednotek se denně přidává domovní odpadní voda pouze do té doby, než se po usazení získá čirá kapalina nad usazeninou. To trvá obvykle až dva týdny, během kterých se obsah rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou na konci každého aeračního cyklu přiblíží konstantní hodnotě.

Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do každé jednotky se předloží 50 ml výsledného směsného kalu.

Do kontrolních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody a 5 ml vody, a do zkušebních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody plus 5 ml příslušného zásobního roztoku zkoušené látky (450 mg.l-1). Znovu se zahájí provzdušňování a pokračuje se v něm 23 hodin. Kal se pak nechá 45 minut usadit, kapalina nad usazeninou se odebere a analyzuje na obsah rozpuštěného organického uhlíku.

Výše uvedený postup plnění a odběru se opakuje v průběhu zkoušky denně.

Může se ukázat nutným očistit před usazováním stěny jednotek, aby se předešlo hromadění tuhých látek nad hladinou kapaliny. Pro každou jednotku se používá samostatná stěrka nebo kartáč, aby se předešlo vzájemné kontaminaci.

V ideálním případě se rozpuštěný organický uhlík stanoví v kapalinách nad usazeninami denně, i když jsou přípustné méně časté analýzy. Před analýzou se kapaliny zfiltrují přes promyté 0,45 µm membránové filtry nebo se zcentrifugují. Membránové filtry jsou vhodné, je-li zaručeno, že ani neuvolňují uhlík, ani ve filtračním kroku neabsorbují příslušnou látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odstředivce, nesmí přesáhnout 40 °C.

Doba trvání zkoušky pro látky, U kterých dochází k malému nebo žádnému biologickému rozkladu není určena, ale na základě zkušenosti lze doporučit, aby trvala obecně nejméně 12 týdnů, avšak ne déle než 26 týdnů.

XII.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

Hodnoty koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v čiré kapalině nad usazeninami ve zkušebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou proti času.

Po skončení biologického rozkladu se koncentrace zjištěná ve zkoušce přiblíží hodnotě v kontrolní jednotce. Jakmile se ve třech po sobě následujících měřeních zjistí, že rozdíl mezi oběma úrovněmi je konstantní, provede se takový počet dalších měření, který je postačující pro statistické vyhodnocení výsledků, a vypočte se procentní hodnota biologického rozkladu zkoušené látky (Dda nebo Dred, viz 1. 2).

XII.3 ZPRÁVA

XII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:

veškeré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky a o experimentálních výsledcích týkajících se zkoušené látky, referenční látky ( pokud byla použita) a slepé zkoušky,

teplotu,

křivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2),

datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd.,

vědecké důvody pro veškeré změny v postupu zkoušky,

podpis a datum.

XII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Protože látky zkoušené touto metodou nejsou snadno biologicky rozložitelné, bude normálně jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnů nebo týdnů, postupný, s výjimkou případů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkoušené látky po několika týdnech.

Někdy může hrát významnou úlohu fyzikálně-chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo částečným úbytkem přidaného DOC na začátku. K čemu dojde potom, závisí na činitelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité odcházející vodě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkoušce postupně vzrůstá z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotě po zbytek experimentu,.

Je-li třeba rozlišit mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné další zkoušky. Je možné je provést řadou způsobů, ale nejpřesvědčivější je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkoušce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkoušce).

Zkoušené látky, u kterých v této zkoušce dochází k vysokému neadsorpčnímu úbytku DOC, je třeba považovat za potenciálně biologicky rozložitelné. Částečný neadsorpční úbytek ukazuje, že u látky dochází alespoň k určitému biologickému rozkladu.

Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkoušenou látkou, což se může projevit také lyží a ztrátou kalu, takže kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkoušku je nutné opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.

Vyšší citlivosti je možné dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo sloučeniny značené 14C. V případě zkoušené látky značené uhlíkem 14C se zachycením 14CO2 potvrdí, že došlo k biologickému rozkladu.

Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je třeba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátě odezvy u mateřské zkoušené látky.

Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjištěnou u média ve slepé zkoušce.

XII.4 LITERATURA

(1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

PŘÍLOHA 1

Zkouška SCAS: příklad výsledků

LátkaCT
(mg.l-1)
C1 - Cc
(mg.l-1)
Procento biolog.
rozkladu Dda
Doba trvání
zkoušky
(dny)
4 -acetylaminobenzen sulfonan17,22,08540
tetrapropylenbenzen sulfonan17,38,451,440
4 - nitrofenol16,90,895,340
diethylenglykol16,50,298,840
anilin16,91,795,940
cyklopentantetra-karboxylát17,93,281,1120

PŘÍLOHA 2

Příklad zkušební aparatury

Příklad zkušební aparatury

XIII. METODA PRO STANOVENÍ BIOAKUMULACE - PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH - metoda C.13 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. záři 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek

XIII.1 METODA

Tato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996).

XIII.1.1 Úvod

V této metodě je popsán postup pro charakterizování potenciálu látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, semistatické režimy se připouštějí, jsou-li splněna kritéria validace.

V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkušebních látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log Pov od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Pov > 6,0). Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označován jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v rovnovážném stavu (BCFss), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log Pov až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k1), rychlostní konstanta vylučování (k2) a BCFss.

Zkušební látky značení radioizotopy mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů odbourávání. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zůstatku (například spálením nebo solubilizací tkáně), zakládá se hodnota BCF na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny.

V metodách se značením radioaktivními izotopy mohou být pro stanovení výchozí sloučeniny zařazeny purifikační postupy, a je-li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací reziduí v tkáních.

XIII.1.2 Definice a jednotky

Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkušební látky v organismu (v jeho specifické tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkušební látky v okolním médiu.

Bioakumulační faktor (BCF nebo KB) je koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (Cf v µg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (Cw v µg/ml (ppm)), a to v každém okamžiku fáze příjmu při této zkoušce.

Bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFSS nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkušební látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.

Plató nebo rovnovážný stav je stav dosažený tehdy, je-li při grafickém vyjádření křivka časové závislosti koncentrace zkušební látky v rybách (Cf) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy Cf vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ±20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se sdružené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkušebních látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly.

Bioakumulační faktory vypočtené přímo z rychlostních konstant kinetiky (k1/k2) se nazývají kinetické koncentrační faktory (BCFk).

Rozdělovací koeficient. oktanol-voda (Pov) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v n-oktanolu a ve vodě (metoda A.8) a označuje se také jako Kow. Logaritmus hodnoty Pov se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.

Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkušební chemikálii.

Rychlostní konstanta příjmu (k1) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vystaveny (k1 se vyjadřuje ve jednotce den-1).

Po-expoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).

Rychlostní konstanta vylučování (k2) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje (k2 se vyjadřuje ve jednotce den-1).

XIII.1.3 Princip zkušební metody

Zkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a po-expoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu exponovány alespoň dvěma koncentracím zkušební látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkušební látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není-li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je-li BCF menší než 10). Koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkušební látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány pozaďové koncentrace zkušební látky.

Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkušební látky. Je-li to možné, vypočítají se bioakumulační faktory nejlépe jako poměr (BCFss), tj. poměr koncentrace v rybách (Cf) a ve vodě (Cw) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k1) a vylučování (k2) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí-li se zjevně naměřené hodnoty kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5).

Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování.

Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta vylučování (úbytku) (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely), bioakumulační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkušební látky v rybách a ve vodě. Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být použity specifikované tkáně nebo orgány (svalovina, játra), je-li ryba dostatečně velká nebo je-li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilií, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilií (tj. s log Pov > 3), měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku.

Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkušební látky.

XIII. 1.4 Informace o zkušební látce

Před prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkušební látce známy tyto informace:

a) rozpustnost ve vodě,

b) rozdělovací koeficient oktanol-voda Pov (označovaný také jako Kow, stanovený metodou HPLC, viz A.8),

c) hydrolýza,

d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3),

e) povrchové napětí (tj. u látek, u nichž nelze stanovit log Pov),

f) tlak par,

g) popřípadě ochota k biologickému odbourávání.

Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC50 (tj. časově nezávislá). Musí být k dispozici vhodná analytická metoda o známé správnosti, přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkušební látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkušební látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkušební látka značená 14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech.

XIII.1.5 Platnost zkoušky

Aby zkouška platila, měly by platit následující podmínky:

kolísání teploty je menší než ±2 °C,

koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení,

koncentrace zkušební látky v nádrži je udržována v intervalu ±20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu,

mortalita nebo jiné nepříznivé účinky/choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %.

XIII.1.6 Referenční sloučeniny

Použití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu je popřípadě užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím nelze ještě doporučit žádné specifické látky.

XIII.1.7 Popis zkušební metody

XIII.1.7.1 Přístroje a pomůcky

V případě všech částí zařízení je třeba se důsledně vyhýbat použití materiálů, které mají schopnost rozpouštět, sorbovat nebo vyluhovat a mají nepříznivý účinek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Měly by být použity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zkušenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je potřebné silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno.

XIII.1.7.2 Voda

Ve zkoušce se používá přírodní voda a měla by být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní přežití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v průběhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální klinický zjev nebo chování. V ideálním případě by mělo být prokázáno, že testovací druh může v ředicí vodě přežít, růst a rozmnožovat se (např. zkouškou s laboratorní kulturou nebo zkouškou toxicity během životního cyklu). Voda by měla být charakterizována alespoň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem nerozpuštěných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou á v případě mořských druhů salinitou. Všechny parametry, které jsou důležité pro optimální prospívání ryb, jsou známy, v příloze I jsou přesto uvedeny doporučené maximální koncentrace pro řadu parametrů sladkovodní a mořské vody.

Voda by měla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by měla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ±0,5. Pro ujištění, že voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkušební látkou) nebo nepříznivý vliv na stav obsádky ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů, kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidů (např. celkový obsah organofosforových a organochlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek by měl být proveden každé tři měsíce, je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).

Celkový přirozený obsah částic a rovněž obsah organického uhlíku (TOC) v ředicí vodě by měl být co nejnižší, aby nedošlo k absorpci zkušební látky na organických látkách, což může snížit její biologickou dostupnost (4). Maximální přijatelná hodnota je 5 mg/l pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 µm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz příloha II). Je-li to nezbytné, měla by být voda před použitím filtrována. Příspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytků potravy by měl být co nejmenší. V průběhu zkoušky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkušební nádrži překročit koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkušební látky a z rozpouštědla, je-li použito, o více než 10 mg/l (±20 %).

XIII.1.7.3 Zkušební roztoky

Zásobní roztok zkušební látky se připraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protřepáním zkušební látky s ředicí vodou. Použití rozpouštědel nebo dispersantů (solubilizačních činidel) se nedoporučuje; může však být v některých případech nezbytné pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci. Rozpouštědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Zkušební látka může být značena radioaktivními izotopy a měla by být nejvyšší čistoty (např. > 98%).

Pro průtokové zkoušky je pro zajištění koncentrací testované látky nezbytný systém, který plynule dávkuje a ředí zásobní roztok zkušební látky (např. dávkovací čerpadlo, proporcionální dávkovač, saturační systém). Přijatelná je výměna nejlépe pěti objemů v každé zkušební nádrži za den. Upřednostňuje se průtokový režim, není-li to však možné (např. jsou-li testovací organismy nepříznivě ovlivňovány), může být použita semi-statická technika za předpokladu, že jsou splněna kritéria validity. Rychlosti průtoku zásobního roztoku a ředicí vody by měly být kontrolovány jak 48 hodin před zkouškou, tak poté alespoň denně během zkoušky. Tato kontrola by měla zhrnovat stanovení rychlosti průtoku v každé testovací nádrži a měla by- zajistit, aby se rychlost průtoku neměnila o více než 20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi nádržemi.

XIII.1.7.4 Výběr druhů

Důležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoři. Dalšími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreační, komerční a ekologický význam a rovněž srovnatelná citlivost, úspěšné dřívější použití atd. Doporučené druhy jsou uvedeny v příloze II. Mohou být použity jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

XIII.1.7.5 Chov ryb

Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoň dva týdny při zkušební teplotě a krmí se odpovídající potravou stejného typu jako v průběhu zkoušky.

Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použijí se následující kritéria:

úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;

úhyn 5 až 10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalších sedm dnů;

úhyn nižší než 5 % populace za sedm dnů: násada se přijímá; dojde li během dalších sedmi dnů k úhynu vyššímu než 5 %, celá násada se vymění.

Zajistí se, aby ryby použité pro. zkoušku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vymění. Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny nemoci u ryb.

XIII.1.8 Provedení zkoušky

XIII.1.8.1 Předběžná zkouška

Může být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkušební látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování.

XIII.1.8.2 Délka fáze příjmu

Předpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo z akumulace podobné chemikálie) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě, nebo rozdělovacího koeficientu oktanol-voda pro zkušební látku (viz příloha 3).

Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve.

XIII.1.8.2.2 Délka fáze vylučování

Doba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby došlo k přiměřenému (např. 95%) snížení obsahu látky v organismu (vysvětlení odhadu viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95% úbytku je neúčelně dlouhá, překračuje například dvakrát normální délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkušební látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký je popsán modelem ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylučování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkušební látky v rybách nad mezí detekce analytické metody.

XIII.1.8.2.3 Počet testovacích ryb

Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby pro každý odběr byly k dispozici čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li požadována větší statická síla, bude na vzorek nezbytných více ryb.

Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity ryby samičího nebo samčího pohlaví (nebo - uvede se pohlaví ryb použitých v experimentu). V případě použití obou pohlaví společně by mělo být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu tuku mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné.

V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že se jeví, že stáří a hmotnost ryby mají často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost.

XIII.1.8.2.4 Násada

Volí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace Cw způsobené přidáním ryb na začátku zkoušky a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druh. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je-li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkušební látky může být udržována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení.

Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném obejmu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb.

XIII.1.8.2.5 Krmení

Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou potravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento vypočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží.

Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží denně krátce po krmení (30 minut až jednu hodinu). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkušební látky (1).

Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkušební látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů.

XIII.1.8.2.6 Světlo a teplota

Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (±2 °C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototransformaci zkušební látky za světelných podmínek studie. Měly by být použito vhodné osvětlení, aby nedošlo k expozici ryb fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm.

XIII.1.8.2.7 Zkušební koncentrace

Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkušební látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkušební látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC50 a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použití analytické metody. Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC50 příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to možné, volí se druhá (další) koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC50 nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkušební látky značené 14C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky.

Je-li použito rozpouštěcí činidlo, neměla by být jeho koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkušební látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Avšak maximální snaha by měla být vynaložena k zamezení použití takovýchto látek .

XIII.1.8.2.8 Kontroly

Vedle zkušební série by měla být založena kontrola sestávající z ředicí vody, která popřípadě obsahuje rozpouštěcí činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá žádné účinky na ryby. Není-li tomu tak, měly by být založeny obě kontroly.

XIII.1.8.3 Četnost měření kvality vody

V průběhu zkoušky by měly být v každé nádrži měřeny množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolách a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny alespoň třikrát - na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu - a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži.

XIII.1.8.4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody

XIII.1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorků ryb a vody

Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkušební látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkušební látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.

Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti.

Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty Pov, jejíž pomocí se vypočítá expoziční doba pro 95% příjem.

V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do ustavení rovnovážného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není-li rovnovážného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru se vzorků se pokračuje do ustavení rovnovážného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží.

XIII.1.8.4.2 Odběr vzorků a příprava vzorků

Vzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkušební látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log Pov > 5) (1), (5), nemohou být vzorky takto zpracovány. Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby nádrže byly udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování.

Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, osuší se „do sucha“, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se.

Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání zpoždění ve stanovení plató při jeho dosažení.

Nedojde-li k okamžité analýze, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkušební látku - například hluboké zmrazení, udržování při 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd.

XIII.1.8.4.3 Kvalita analytické metody

Vzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkušební látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkušební látky jak z vody, tak ze vzorů ryb jsou pro dotyčnou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkušební látka nevyskytuje v použité ředicí vodě.

Hodnoty Cw a Cf se podle potřeby korigují podlé výtěžku a pozaďových hodnot kontrol. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku absorpce odběrovým zařízením).

XIII.1.8.4.4 Analýza vzorků ryb

Je-li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu s celkovou aktivitou (tj. s výchozí látkou i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. V rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve, mohou být stanoveny také hlavní metabolity. Je-li hodnota BCF vypočtená z celkové aktivity reziduí ≥ 1 000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, je to důrazně doporučeno, identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v rovnovážném stavu. Jsou-li produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkové aktivity reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání ve vodě.

Koncentrace zkušební látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na data aplikovat. Pokud na specifickém statistickém postupu a na síle záleží, měl by být ve zkoušce nasazen dostatečný počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a požadované síle (6), (7).

Hodnota BCF by měla být vyjádřena jako funkce celkové živé hmotnosti a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu tuku. Obsah tuku v rybách se stanoví pokud možno při každém odběru. Pro stanovení obsahu tuku by měla být použita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v příloze 3). Jako standardní metoda může být doporučena technika extrakce do chloroformu/methanolu (9). Různě metody nedávají stejné hodnoty (10), je proto důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je-li to možné, měla by být analýza tuků provedena na extraktu připravenému pro analýzu zkušební látky, neboť tuky musí být často před chromatografickou analýzou odstraněny. Obsah tuku v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci experimentu by se neměl lišit od obsahu na počátku od více než ±25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést přepočet koncentrace tuků z živé hmotnosti na hmotnost sušiny.

XIII.2 DATA

XIII.2.1 Zpracování výsledků

Křivka příjmu zkušební látky se sestrojí vynesením její koncentrace v rybách nebo na nich (nebo ve specifikovaných tkáních) v průběhu fáze příjmu proti času v lineárním měřítku. Dosáhla-li křivka plató, tj. začíná být rovnoběžná s časovou osou, vypočítá se hodnota BCFss v rovnovážném stavu z poměru

Cf v rovnovážném stavu (střední hodnota)
—————————————————————
Cw v rovnovážném stavu (střední hodnota)

Není-li rovnovážného stavu dosaženo, je možné vypočítat hodnotu BCFss s dostatečnou přesností pro posouzení rizika z „rovnovážného stavu v 80% (1,6/k2) nebo 95% (3,0/k2) rovnováze. Také koncentrační faktor BCFk se stanoví jako poměr dvou rychlostních konstant prvního řádu k1/k2. Rychlostní konstanta vylučování se obvykle stanoví z křivky vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkušební látky v rybách v čase). Rychlostní konstanta příjmu se poté vypočte pomocí hodnoty k2 a hodnoty Cf odvozené z křivky příjmu (viz také příloha 5). Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty BCFk a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače (11). K výpočtu hodnot k1 a k2 lze jinak použít grafické metody. Není-li zjevně křivka vylučování křivkou prvního řádu, měly by být použity složitější modely (viz odkazy v příloze 3) a měl by být konzultován biostatistik.

XIII.2.2 Interpretace výsledků

Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že naměřené koncentrace zkušebních roztoků se pohybují na úrovních blízkých mezi detekce analytické metody.

Jasně vymezené křivky příjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré kvality dat o bioakumulaci. Rozdíl konstant příjmu/vylučování pro dvě zkušební koncentrace by měl být nižší než 20 %. Pozorované významné rozdíly v rychlostech příjmu/vylučování mezi dvěma použitými zkušebními koncentracemi by měly být zaznamenány a mělo by být uvedeno jejich možné vysvětlení. Interval spolehlivosti hodnot BCF u dobře navržených studií se všeobecně blíží ±20 %.

XIII.3 ZPRÁVY

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XIII.3.1 Zkušební látka

fyzikální povaha a popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,

chemické identifikační údaje (včetně obsahu organického uhlíku, je-li to třeba),

v případě značení radioaktivními izotopy jejich přesná poloha a aktivita příměsí, vyjádřená v procentech.

XIII.3.2 Testovací druh

vědecký název, kmen, zdroj, případné předběžné ošetření, aklimatizace, stáří, rozpětí velikostí atd.

XIII.3.3 Zkušební podmínky

použitý zkušební postup (např. průtokový nebo semistatický),

typ a charakteristiky použitého osvětlení a fotoperioda (fotoperiody),

uspořádání zkoušky (např. počet a velikost zkušebních nádrží, rychlost výměny objemu vody, počet opakování, počet ryb v jednom opakování, počet zkušeních koncentrací, délka fází příjmu a vylučování, četnost odběru vzorků ryb a vzorků vody),

metoda přípravy zásobních roztoků a častost jejich obnovování (je-li použito rozpouštěcí činidlo,musí být uvedena jeho koncentrace a jeho příspěvek k obsahu organického uhlíku ve vodě),

nominální zkušební koncentrace, střední hodnoty naměřených koncentrací ve zkušebních nádržích, jejich směrodatné odchylky a metody jejich stanovení,

zdroj ředicí vody, popis jakékoliv předchozí úpravy, výsledky jakéhokoliv prokazování schopnosti zkušebních ryb žít v této vodě a charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, úroveň zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, (popřípadě) salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoliv jiných provedených měření,

kvalita vody ve zkušebních nádržích, hodnota pH, tvrdost vody, obsah TOC, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,

podrobné informace o krmení (například typ krmiva, zdroj, složení -alespoň pokud možno obsah tuku a bílkovin, podávané množství a četnost),

informace o zpracování vzorků ryb a vody, včetně podrobností o přípravě, uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a přesnosti), pokud jde o zkušební látku a obsah tuku (je-li měřen).

XIII.3.4 Výsledky

výsledky jakýchkoliv provedených předběžných studií,

úhyn kontrolních ryb a ryb v každé expoziční nádrži a jakékoliv pozorované neobvyklé chování,

obsah tuku v rybách (je-li stanoven při zkoušce),

křivky (včetně všech naměřených dat) příjmu a vylučování zkušební chemikálie rybami, doba dosažení rovnovážného stavu,

hodnoty Cf a Cw (popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozpětím) pro všechny odběry (hodnota Cf se vyjadřuje v µg/g živé hmotnosti (ppm) celého těla nebo specifikované tkáně, např. tuku, a Cw se vyjadřuje v µg/ml (ppm)); hodnoty Cw pro kontroly (měly by být uvedeny také hodnoty pozadí),

bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFss) a/nebo kinetický koncentrační faktor (BCFk) a popřípadě 95% intervaly spolehlivosti pro rychlostní konstanty příjmu a vylučování (úbytku) (vše vztaženo na celý organismus a na celkový obsah tuku v rybě, je-li stanoven, nebo na její specifikovanou tkáň), intervaly spolehlivosti a směrodatné odchylky (jsou-li k dispozici) a metody výpočtu/analýzy dat pro každou použitou koncentraci zkušební látky,

v případě použití látek značených radioaktivními izotopy a je-li to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoliv detekovaných metabolitů,

všechny zvláštnosti zkoušky, všechny odchylky od těchto postupů a ostatní relevantní informace.

Všem výsledkům typu „nedetekováno při uvedené mezi detekce“ by mělo být předcházeno předběžným odzkoušením metod a uspořádání experimentu, neboť takové výsledky nelze použít pro výpočet rychlostních konstant.

XIII.4 LITERATURA

(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.

(2) Bintein S., Devillers .J., Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.

(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration. in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105.

(10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436.

(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method - Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen, N. Nyholm.

(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

PŘÍLOHA 1

Chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody

LátkaKoncentrační limit
1Nerozpuštěné látky5 mg/l
2Celkový obsah organického uhlíku2 mg/l
3Neionizovaný amoniak1 µg/l
4Zbytkový chlor10 µg/l
5Celkové organofosforové pesticidy50 ng/l
6Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly50 ng/l
7Celkový organický chlor25 ng/1
8Hliník1 µg/l
9Arsen1 µg/1
10Chrom1 µg/l
11Kobalt1 µg/l
12Měď1 µg/l
13Železo1 µg/1
14Olovo1 µg/l
15Nikl1 µg/l
16Zinek1 µg/1
17Kadmium100 ng/1
18Rtuť100 ng/l
19Stříbro100 ng/l

PŘÍLOHA 2

Doporučené druhy ryb pro zkoušení

Doporučený druhDoporučené
rozpětí zkušební
teploty
(°C)
Doporučená celková
délka těla
testovacích jedinců
(cm)
1Danio rerio1 (Teleostei, Cyprinidae)
(Hamilton-Buchanan), danio pruhované
20 - 253,0 ± 0,5
2Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
(Rafinesque), střevle
20 - 255,0 ± 2,0
3Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)
(Linnaeus), kapr obecný
20 - 255,0 ± 3,0
4Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
(Temminck and Schlegel), halančík japonský
20 - 254,0 ± 1,0
5Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)
(Peters), živorodka duhová
20 - 253,0 ± 1,0
6Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
(Rafinesque), slunečnice
20 - 255,0 ± 2,0
7Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)
(Walbaum), pstruh duhový
13 - 178,0 ± 4,0
8Gasterosteus aculeatus (Teleostei Gasterosteidae)
(Linnaeus), koljuška tříostná
18-203,0 ± 1,0

1 Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.

V různých zemích byly použity různé druhy estuarinních a mořských druhů, například:

ryba z čeledi Scienidae (Smuhovití)Leiostomus xanthurus
halančíkCyprinodon variegatus
ryba z čeledi Argentinidae (Stříbronicovití)Menidia beryllina
ryba z čeledi Enbiotocidae (Příbojkovití)Cymatogaster aggregata
platýz z čeledi PleuronectidaeParophrys vertulus
vranka z čeledi CottidaeLeptocottus armatus
koljuška tříostnáGasterosteus aculeeatus
mořčák z čeledi MoronidaeDicentracus labrax
ouklej obecnáAlburnus alburnus

Dostupnost ryb

Sladkovodní ryby uvedené v seznamu se snadno chovají a/nebo jsou dobře dostupné po celý rok, zatímco dostupnost mořských nebo estuarijních ryb je omezena na určité země. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.

PŘÍLOHA 3

Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování

1. Předpověď délky fáze příjmu

Před provedením zkoušky lze získat odhad hodnoty k2 a odtud lze získat dobu nezbytnou pro dosažení určitého stupně rovnovážného stavu (v procentech) z empirických vztahů mezi k2 a rozdělovacím koeficientem n-oktanol/voda (Pov) nebo mezi k2 a rozpustností ve vodě (s).

Odhad hodnoty k2 (den-1) lze získat například z následujícího empirického vztahu (1):

log10k2 = − 0,414 log10(Pov) + 1,47 (r2 = 0,95) (1)

Další vztahy viz odkaz 2.

Není-li rozdělovací koeficient (Pov) znám, lze jej odhadnout (3) ze znalosti rozpustnosti látky ve vodě (s) pomocí vztahu:

log10(Pov) = 0,862 log10(s) + 0,710(r2 = 0,994) (2)

kde s = rozpustnost (v mol/l): (n = 36).

Tyto vztahy platí pouze pro chemikálie s hodnotou log Pov od 2 do 6,5 (4).

Dobu, za kterou dojde k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, lze získat pomocí odhadu hodnoty k2, z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu):

dCf
—— = k1 · Cw − k2 · Cf
dt

nebo je-li Cw konstanta:

k1
Cf = · Cw (1−e-k2t) (3)
k2

Blíží-li se rovnovážný stav (t→∞), může být rovnice 3 zjednodušena (5), (6) na

k1
Cf = · Cw nebo Cf/Cw = k1/k2 = BCF
k2

Pak k1/k2· Cw přiblížením koncentrace v rybách v „rovnovážném stavu“ (Cf,s).

Rovnice 3 může být přepsána na rovnici:

Cf
Cf = Cf,s (1 − e-k2t) nebo —— = 1 − e-k2t (4)
Cfs

Použitím rovnice 4 lze předpovědět dobu potřebnou k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, je-li hodnota k2 předem odhadnuta z rovnice 1 nebo 2.

Je pravidlem, že statisticky optimální délka fáze příjmu pro získání statisticky přijatelných dat (BCFk) je doba nezbytná k tomu, aby křivka sestrojená vynesením logaritmu koncentrace zkušební látky v rybách proti času v lineárním měřítku dosáhla svého středního bodu, popřípadě 1,6k2, neboli 80 % rovnovážného stavu, ale ne více než 3,0k2, neboli 95 % rovnovážného stavu (7).

Doba nezbytná pro dosažení 80 % rovnovážného stavu je při použití rovnice 4:

1,6
0,80 = 1 − e-k2t80 nebo t80 =—— (5).
k2

Podobně 95 % rovnovážného stavu je dosaženo:

3,0
t95 = —— (6).
k2

Například délka fáze příjmu (up) pro zkušební látku s log Pov = 4 je (při použití rovnic 1, 5 a 6):

log10k2= − 0,414·(4) + 1,47 k2 = 0,652 den-1

up (80 %) = 1,6/0,652,   tj. 2,45 dnů (59 hodin)

nebo up (95 %) = 3,0/0,652,  tj. 4,60 dnů (110 hodin).

Podobně pro zkušební látku s hodnotou s = 10-5 mol/l (log(s) = 5,0) je délka fáze (při použití rovnic 1, 2, 5 a 6):

log10(Pov) = 0,862 (−5,0) + 0,710 = 5,02

log10k2= − 0,414 (5,02) + 1,47

k2 = 0,246 den-1

up (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dnů (156 hodin)

nebo up (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dnů (293 hodin).

Rovnice

teq = 6,54 × 10-3 Pov + 55,31 (hodin)

může být eventuelně použita pro výpočet doby potřebné pro dosažení efektivního rovnovážného stavu (4).

2. Předpověď délky fáze vylučování

Předpověď doby nezbytné pro snížení obsahu látky v organismu na určitou procentuální úroveň počáteční koncentrace může být rovněž získána z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu) (1), (8):

V případě fáze vylučování se Cw předpokládá rovna nule. Rovnice může být zjednodušena na rovnici:

dC f
—— = k1 · Cw nebo Cf = Cf,0 · e-k2t
dt

kde Ct,0 je koncentrace na počátku fáze vylučování. 50% vyloučení bude dosaženo v čase (t50):

Cf10,693
—— = = e-k2t nebo t50 = ———
Ct,02k2

Podobně 95% vyloučení bude dosaženo v čase

3,0
t95 = ——
k2

Je-li pro první fázi zvoleno dosažení 80% příjmu (1,6/k2) a pro fázi vylučování je zvoleno dosažení 95% úbytku (3,0/k2), je délka fáze vylučování přibližně dvojnásobkem délky fáze příjmu.

Je však důležité poznamenat, že odhady jsou založeny na předpokladu, že se příjem a vylučování řídí kinetikou prvního řádu. Neřídí-li se zjevně kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (např. odkaz (1)).

Literatura (k příloze 3)

(1) Spacie A., Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320.

(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3) Chiou C. T., Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10.

(4) Hawker D. W., Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707.

(5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C., Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792.

(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W., Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.

(7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R., Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kisnetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622.

(8) Könemann H., Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19.

PŘÍLOHA 4

Teoretický příklad plánu odběru vzorků pro bioakumulační zkoušky látek s logPov = 4

Odběr vzorků rybPlán dob odběru vzorkůPočet vzorků vodyPočet ryb na vzorek
Minimální
požadovaná
četnost
(dny)
Dodatečný odběr
vzorků
Fáze příjmu−1 02(*)
2
Přídavek 45 až 80
ryb
1.0,30,42
(2)
4
(4)
2.0,60,92
(2)
4
(4)
3.1,21,72
(2)
4
(4)
4.2,43,32
(2)
4
(4)
5.4,726
Fáze vylučováníPřenesení ryb do
vody neobsahující
zkušební
chemikálii
6.5,05,34
(4)
7.5,97,04
(4)
8.9,311,24
(4)
9.14,017,56
(4)

(*) Odběr vzorku vody po dodání alespoň tří „objemů nádrže“.

Hodnoty v závorkách jsou počty vzorků (vody, ryb), které mají být odebrány, je prováděn dodatečný odběr.

Poznámka: Předběžný odhad k2 pro logPov rovný 4,0 je 0,652 den-1. Celková délka experimentu je stanovena na

3 × up = 3 × 4,6 dnů, tj. 14 dnů. Odhad hodnoty „up“ viz příloha 3.

PŘÍLOHA 5

Omezení modelu

U většiny bioakumulačních dat se předpokládá, že jsou „rozumně“ dobře popsány jednoduchým modelem se dvěma kompartmenty/dvěma parametry, jak je patrné z přímky, která aproximuje body pro koncentrace v rybách během fáze vylučování, je-li vynesena na semilogaritmickém papíru. (Nelze-li tyto body popsat přímkou, měl by být použit složitější model (viz například Spacie a Hamelik, odkaz 1 v příloze 3).

Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty vylučování (úbytku) k2

Koncentrace zkušební látky nalezená v každém vzorku ryb se vynese na semi-logaritmickém papíru proti času odběru vzorků. Směrnice této přímky je rovna k2.

ln(Cf1/Cf2)
k2 = ————
t2 − t1

Obrázek 10

Je třeba si všimnout, že odchylky od přímky mohou znamenat složitější model vylučování, než je kinetika prvního řádu. Pro analýzu typů vylučování, které se odchylují od kinetiky prvního řádu, mohou být použity grafické metody.

Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty příjmu k1

Při dané konstantě k2 se k1 vypočte následujícím způsobem:

Cf k2
k1 = —————— (1)
Cw × (1 − e-k2t)

Hodnota Cf se odečte ze středního bodu hladké křivky příjmu vytvořené vynesením logaritmu koncentrace proti času (v lineárním měřítku).

Metoda výpočtu rychlostních konstant příjmu a vylučování (úbytku) s využitím počítače

Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty bioakumulačního faktoru a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače. Těmito programy se naleznou hodnoty k1 a k2 založené na sadě po sobě jdoucích dat koncentrací a na modelu:

k1
Cf =Cw · × (1 − e-k2t) 0 < t < tc (2)
k2
k1
Cf =Cw · × (e-k2(t−tc) − e-k2t) t < tc (3)
k2

kde tc = čas konce fáze příjmu.

Tento přístup poskytuje odhady směrodatné odchylky k1 a k2.

Vzhledem k tomu, že ve většině případů lze odhadnout k2 z křivky vylučování s relativně vysokou přesností a vzhledem k tomu, že mezi těmito dvěma parametry k1 a k2 existuje silná korelace, jsou-li odhadovány současně, může být účelné nejdříve vypočítat k2 pouze z dat vylučování a následně vypočítat k1 z dat příjmu pomocí nelineární regrese.

XIV. METODA PRO STANOVENÍ RŮSTU NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH - metoda C.14 podle přílohy směrnice Komise 2001/59/ES ze dne 6. srpna 2001, kterou se po dvacáté osmé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 2001/59/ES“)

XIV.1 METODA

Metoda růstové zkoušky pro stanovení toxicity je replikou metody OECD TG 215 (2000).

XIV.1.1 ÚVOD

Zkouška je určena k posouzení účinků dlouhodobé expozice chemickým látkám na růst nedospělých ryb. Je založena na metodě pro posouzení účinků chemických látek na růst nedospělého pstruha duhového (Oncorynchus mykiss) při průtokových podmínkách, která byla vyvinuta v Evropské unii a testována v okružních testech (1, 3). Mohou být použity také jiné dobře popsané druhy. Byly například získány zkušenosti z růstových zkoušek s daniem pruhovaným (Danio rerio) (2, 4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8).

Viz také obecný úvod, část C.

XIV.1.2 DEFINICE

Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou u látky pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.

NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

ECx: je pro tuto metodu koncentrace zkoušené látky, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu ryb ve srovnání s kontrolami.

Velikost násady: je živá hmotnost ryb v jednotce objemu vody.

Hustota obsádky: je počet ryb v jednotce objemu vody.

Individuální specifická rychlost růstu ryby: vyjadřuje rychlost růstu jedince vycházející z jeho výchozí hmotnosti.

Průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž: vyjadřuje střední rychlost růstu populace v nádrži při určité koncentraci.

Pseudospecifická rychlost růstu: vyjadřuje rychlost růstu jednotlivce vycházející ze střední počáteční hmotnosti populace v nádrži.

XIV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Nedospělé ryby v exponenciální fázi růstu se po zvážení umístí do zkušebních nádrží a vystaví se řadě subletálních koncentrací zkoušené látky nejlépe za průtokových podmínek, nebo, pokud možno za vhodných semistatických podmínek (statické podmínky s obnovením média). Zkouška trvá 28 dnů. Ryby se krmí denně. Přísun potravy se řídí počáteční hmotností ryb a může být po 14 dnech nově vypočten. Na konci zkoušky se ryby opět zváží. Účinky na rychlost růstu se analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu, tj. ECx (např. EC10, EC20 nebo EC30). Data mohou být popřípadě porovnána s hodnotami pro kontrolní skupiny s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC).

XIV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

Výsledky zkoušky akutní toxicity (viz zkušební metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku již musí být předloženy. To znamená, že jsou známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a je k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.

Užitečnými informacemi jsou strukturní vzorec, čistota látky, její stálost ve vodě a na světle, pKa, Po/v a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz zkušební metoda C.4).

XIV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:

mortalita v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %,

nárůst střední hodnoty hmotnosti ryb v kontrolní skupině (skupinách) musí být dostatečný na to, aby umožnil rozeznat minimální významnou změnu rychlosti růstu. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového musí střední hmotnost ryb v kontrolních skupinách vzrůst alespoň o polovinu (tj. o 50 %) jejich počáteční hmotnosti za 28 dnů; např. počáteční hmotnost: 1 g/rybu (= 100 %), konečná hmotnost po 28 dnech: ≥ 1,5 g/rybu (≥ 150 %),

koncentrace rozpuštěného kyslíku musí dosahovat alespoň 60 % hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,

teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi lišit o více než ± 1 °C a měla by být udržována v rozpětí 2 °C v rozsahu teplot stanovených pro zkušební druh (dodatek 1).

XIV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XIV.1.6.1 Přístroje a pomůcky

Normální laboratorní vybavení a zejména:

a) oxymetr a pH metr;

b) vybavení pro stanovení tvrdosti vody a alkality;

c) vhodné zařízení pro regulaci teploty a pro její pokud možno nepřetržité sledování;

d) nádrže z chemicky inertního materiálu o vhodném objemu vzhledem k doporučenému nasazování a obsádce (viz bod 1.8.5 a dodatek 1);

e) vhodné přesné váhy (tj. vážící s přesností na ± 0,5 %).

XIV.1.6.2 Voda

Jako zkušební voda může být použita jakákoli voda, v níž zkušební druh dlouhodobě přežívá a roste. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH vody by měla být v rozmezí 6,5 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ± 0,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO3). S cílem zajistit, aby ředicí voda neměla nadměrný vliv na výsledek zkoušky (například v důsledku tvorby komplexů zkušební látky), by měly být v určitých intervalech odebírány vzorky k analýze. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců). Některé chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody jsou uvedeny v dodatku 2.

XIV.1.6.3 Zkušební roztoky

Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.

Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním nebo sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony.

V některých případech může být pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné použití rozpouštědel nebo dispergátorů (solubilizačních činidel). Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na růst ryb ani viditelné nepříznivé účinky na nedospělé ryby, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu.

Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být v průběhu zkoušky kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je přijatelná výměna vody 6 litrů na gram ryb za den (viz bod 1.8.2.2).

U semistatických zkoušek (s obnovením média) bude častost obnovování média záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat vodu denně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 - 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška.

XIV.1.6.4 Výběr druhů

Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) je doporučeným druhem pro tuto zkoušku, neboť, u něj bylo v okružních testech získáno nejvíce zkušeností (1, 3). Mohou však být použity jiné dobře popsané druhy, může však být nutné zkušební postup upravit, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. Jsou například zkušenosti s daniem pruhovaným (Danio rerio) (4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). V takovém případě by měly být uvedeny v závěrečné zprávě důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

XIV.1.6.5 Chov ryb

Testovací ryby by měly pocházet z jednoho chovu (nejlépe ze stejného tření), který se alespoň dva týdny před zkouškou udržuje v podmínkách kvality vody a osvětlení, které jsou podobné podmínkám použitým ve zkoušce. V průběhu chovu a v průběhu zkoušky by měly být krmeny množstvím potravy odpovídajícím minimálně 2 % tělesné hmotnosti za den a nejlépe 4 % tělesné hmotnosti za den.

Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:

mortality vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;

mortality od 5 % do 10 % populace: aklimatizace dalších sedm dnů; je-li mortalita během následujících sedmi dnů vyšší než 5 %, vymění se celá obsádka,

mortalita nižší než 5 % populace za sedm dnů: obsádka se přijme.

Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny u ryb žádné nemoci.

XIV.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY

„Uspořádáním zkoušky“ se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet ryb v nádrži. Uspořádání by mělo být v ideálním případě zvoleno s ohledem na:

a) cíl studie;

b) metodu statistické analýzy, která bude použita;

c) dostupnost a cenu prostředků pro experiment.

Požadováno je stanovení statistické významnosti, s jakou má být daná velikost změny (např. změny rychlosti růstu) rozeznána, nebo přesnost, s jakou má být odhadnuta hodnota ECx (např. × = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne méně než 10). Bez toho nelze stanovit přesný rozsah studie.

Je důležité vzít na vědomí, že uspořádání, které je optimální při použití jedné metody statistické analýzy (nejlépe využívá prostředky), není nezbytně optimální pro jinou metodu. Doporučené uspořádání pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspořádání pro analýzu regresí.

V mnoha případech se regresní analýze dává přednost před analýzou variance, a to z důvodů diskutovaných Stephanem a Rogersem (9). Není-li však nalezen vhodný regresní model (r2 < 0,9), měl by být stanoven poměr NOEC/LOEC.

XIV.1.7.1 Uspořádání pro analýzu regresí

Pro uspořádání zkoušky, která má být analyzována regresí, jsou důležité tyto zřetele:

a) koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC10,20,30) a rozsah koncentrací, při nichž dochází ke sledovanému účinku. Přesnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace vyvolávajících účinek, bude nejlepší, bude-li koncentrace vyvolávající účinek ležet uprostřed rozsahu zkušebních koncentrací. Při výběru vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné předběžné orientační zkoušky.

b) aby mohl být vytvořen uspokojivý statistický model, měla by zkouška zahrnovat alespoň jednu kontrolní nádrž a pět dalších nádrží o různých koncentracích. Podle vhodnosti by při použiti solubilizačního činidla měla být vedle zkušebních skupin nasazena jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubilizačního činidla použité při nejvyšší zkušební koncentraci (viz body 1.8.3 a 1.8.4);

c) může být použita vhodná geometrická nebo logaritmická řada koncentrací (10) (viz dodatek 3). Upřednostňuje se logaritmické stupňování koncentrací;

d) je-li k dispozici více než šest nádrží, měly by být další nádrže použity buď pro duplicitní stanovení, nebo by měly být použity pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenšily rozestupy mezi koncentracemi. Obě použití lze doporučit stejnou měrou.

XIV.1.7.2 Uspořádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou variance (ANOVA)

Pro každou koncentraci by měly být nejlépe k dispozici nádrže pro duplicitní stanovení, statistická analýza by měla být provedena pro každou jednotlivou nádrž (11). Bez duplicitních nádrží není možné zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, než jaká je důsledkem rozdílů mezi jednotlivými rybami. Zkušenosti ale ukazují (12), že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami). Relativně přijatelnou alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby.

Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2.

Provádí-li se zkouška s duplicitními nádržemi, mel by být počet duplicitních kontrolních nádrží, a tedy i počet ryb, dvojnásobkem počtu ryb pro každou zkoušenou koncentraci, který by měl být pro všechny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou-li naproti tomu duplicitní nádrže použity, měl by být v kontrolní skupině stejný počet ryb jako ve skupině pro každou zkušební koncentraci.

Je-li ANOVA založena na nádržích namísto jednotlivých rybách (což by znamenalo buď ryby jednotlivě označit nebo použít „pseudospecifickou“ rychlost růstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné počet nádrží dostatečně znásobit, aby bylo možné stanovit odchylku pro nádrže v rámci jednotlivé koncentrace. To znamená, že by měl být počet stupňů Volnosti pro chybu v analýze variance alespoň 5 (11). Jsou-li duplicitně použity pouze kontroly, existuje nebezpečí, že bude variabilita chyby vychýlena, neboť může narůstat se střední hodnotou dotyčné rychlosti růstu. Vzhledem k tomu, že rychlost růstu s největší pravděpodobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability.

XIV.1.8 POSTUP .

XIV.1.8.1 Výběr a vážení testovacích ryb

Je důležité minimalizovat rozdíly v hmotnostech ryb na začátku zkoušky. Vhodná rozpětí velikostí ryb různých druhů doporučených pro tuto zkoušku jsou uvedena v dodatku 1. Rozpětí individuálních hmotností na začátku zkoušky by mělo být pro celou násadu ryb použitých ve zkoušce nejlépe ± 10 % aritmetického průměru hmotností a v žádném případě by nemělo překročit 25 %. Doporučuje se zvážit před zkouškou menší vzorek ryb s cílem odhadnout střední hodnotu hmotnosti.

24 hodin před zahájením zkoušky se obsádka ryb přestane krmit. Poté se provede náhodný výběr ryb. Za použití běžného anestetika (např. vodný roztok trikainmethansulfonátu (MS 222) o koncentraci 100 mg/l neutralizovaný přídavkem dvou dílů hydrogenuhličitanu sodného na jeden díl MS 222) se ryby jednotlivě s přesností uvedenou v dodatku 1 zváží za účelem stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha). Ryby s hmotností v požadovaném rozsahu se náhodně rozdělí do nádrží. Zaznamená se celková živá hmotnost ryb v každé zkušební nádrži. Při manipulaci s rybami za použití anestetik (včetně osušení a zvážení) může u nedospělých ryb, a zejména u druhů o malé velikosti, dojít ke stresu a poranění. S nedospělými rybami se tedy musí manipulovat s nejvyšší opatrností, aby nedošlo u zkušebních ryb ke stresu a poranění.

Ryby se opět zváží po 28 dnech zkoušky (viz bod 1.8.6). Považuje-li se však za nezbytné nově vypočítat přísun potravy, mohou být ryby opět zváženy po 14 dnech zkoušky (viz bod 1.8.2.3). Ke stanovení změn velikosti ryb, na jejichž základě se upravuje přísun potravy, může být použita jiná metoda, např. fotografická metoda.

XIV.1.8.2 Podmínky expozice

XIV.1.8.2.1 Délka expozice

Zkouška trvá více než 28 dnů.

XIV.1.8.2.2 Velikost násady a hustota obsádky

Je důležité, aby velikost násady a hustota obsádky vyhovovaly použitému zkušebnímu druhu (viz dodatek 1). Je-li hustota obsádky příliš vysoká, dojde ke stísnění vedoucímu ke snížené rychlosti růstu a popřípadě k nemocem. Je-li příliš nízká, může vyvolat teritoriální chování, což by mohlo rovněž ovlivnit růst. V každém případě by měla být velikost násady tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je velikost násady 16 ryb o hmotnosti 3 - 5 g do objemu 40 litrů přijatelná. Doporučené obnovování vody během zkoušky je 6 litrů na gram ryb za den.

XIV. 1.8.2.3 Krmení

Ryby by měly být krmeny dostatečným množstvím vhodného krmiva (dodatek 1), aby byla umožněna přijatelná rychlost růstu. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k růstu mikroorganismů a k zakalení vody. U pstruha duhového by mělo těmto požadavkům vyhovovat množství odpovídající 4 % jejich tělesné hmotnosti za den (3, 16, 17, 18). Denní množství může být rozděleno na dva stejné podíly a podáno rybám dvakrát za den s odstupem alespoň pěti hodin.

Množství se řídí počáteční hmotností ryb v jednotlivé zkušební nádrži. Ryby se opět zváží 14. den a množství se nově vypočte. 24 hodin před vážením se ryby přestanou krmit. Nespotřebovaná potrava a výkaly se ze zkušebních nádrží každý den odstraní důkladným odsátím ze dna každé nádrže.

XIV. 1.8.2.4 Světlo a teplota

Fotoperioda a teplota vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatek 1).

XIV.1.8.3 Zkušební koncentrace

Obvykle je nutných pět koncentrací zkoušené látky, a to bez ohledu na uspořádání zkoušky (viz bod 1.7.2). Při volbě vhodných zkušebních koncentrací by měla pomoci předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií). Použije-li se méně než pět koncentrací, mělo by být uvedeno odůvodnění. Nejvyšší zkušební koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky ve vodě.

Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo, neměla by být jeho konečná koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná (viz bod 1.6.3). Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.

XIV.1.8.4 Kontrolní skupiny

Počet kontrolních skupin v ředicí vodě závisí na uspořádání zkoušky (viz body 1.7 až 1.7.2). Použije-li se solubilizační činidlo, měl by být nasazen stejný počet kontrolních skupin se solubilizačním činidlem jako s ředicí vodou.

XIV.1.8.5 Častost analytických stanovení a měření

Během zkoušky se v pravidelných intervalech (viz níže) stanovují koncentrace zkoušené látky

Při průtokových zkouškách se průtok zásobních roztoků toxické látky a ředicí vody kontroluje v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10%. Očekávají-li se změny koncentrace zkoušené látky v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 - 120 %, viz body 1.6.2 a 1.6.3), doporučuje se, aby byly nejnižsí a nejvyšší zkoušené koncentrace analyzovány na začátku zkoušky a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to stejně často jako u stabilních látek.

U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot, se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 nominální hodnoty, musí být všechny koncentrace analyzovány stejně často jako u stabilnějších látek.

Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky v roztoku uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených hodnotách.

Může být nezbytné vzorky filtrovat (např. přes filtr velikostí pórů 0,45 um) nebo odstředit. Doporučuje se odstřeďování. Filtrace je přípustná jen neadsorbuje-li se zkoušená látka na filtry.

V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost, alkalita a popřípadě solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u statických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody a alkalita se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.

XIV.1.8.6 Pozorování

Hmotnost: na konci každé zkoušky se musí ryby, které přežily, zvážit za účelem XIV.stanovení živě hmotnosti (po osušení do sucha), a to buď jako skupina pro každou zkušební nádrž, nebo jednotlivě. Vážení ryb jako skupin se upřednostňuje před vážením jednotlivých ryb, které vyžaduje, aby byly ryby jednotlivě označeny. V případě vážení jednotlivých ryb pro stanovení individuální specifické rychlosti růstu by neměla zvolená technika označení vyvolávat u ryb stres (alternativou ke značení ryb vymražením značky může být popřípadě použití barevného rybářského vlasce).

Ryby se v průběhu zkoušky vyšetřují denně a zaznamenávají se jakékoli odchylky (hemoragie, odbarvení) a neobvyklé chování. Každý úhyn se zaznamená a uhynulé ryby se co nejdříve odstraní. Uhynulé ryby se nenahrazují, neboť velikost násady a hustota obsádky by měly být dostatečné na to, aby nedošlo k ovlivnění růstu v důsledku změn počtu ryb. Bude však nutné upravit množství krmiva.

XIV.2 DATA A ZPRÁVY

XIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, v počtu ryb. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.

Rychlost růstu se nevypočítává pro zkušební nádrže, v nichž mortalita překročila 10 %. Velikost mortality se ale uvede pro všechny zkušební koncentrace.

Bez ohledu na použitou metodu je hlavním ukazatelem specifická rychlost růstu r od okamžiku t1 do t2. Může být definována několika způsoby v závislosti na tom, zda jsou či nejsou ryby individuálně značeny nebo zda se požaduje průměrná hodnota pro nádrž.

logew2 − logew1
r1 = ———————× 100
t2 − t1

vzorec 027

kde:

r1 = individuální specifická rychlost růstu ryby

r2 = průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž

r3 = „pseudospecifická“ rychlost růstu

w1, w2 = hmotnosti určité ryby v čase t1 a t2

loge w1 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na začátku vyšetřovacího intervalu

loge w2 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na konci vyšetřovacího intervalu

loge w1 = průměr logaritmů hodnot w1 pro ryby v nádrži na začátku vyšetřovacího intervalu

loge w2 = průměr logaritmů hodnot w2 pro ryby v nádrži na konci vyšetřovacího intervalu

t1, t2 = čas (ve dnech) začátku a konce vyšetřovacího intervalu

r1, r2, r3 mohou být vypočteny pro interval 0 - 28 dnů a popřípadě (bylo-li provedeno měření 14. den) pro intervaly 0 - 14 a 14 - 28 dnů.

XIV.2.1.1 Analýza výsledků regresí (modelování závislosti koncentrace - odezva)

Touto metodou se závislostí mezi specifickou rychlostí růstu a koncentrací proloží vhodná matematická funkce, a to umožní odhadnout „ECx“, tj. jakoukoli požadovanou hodnotu EC. U této metody není nutný výpočet r pro jednotlivou rybu (r1) a namísto toho se analýza založí na průměrné hodnotě r (r2) pro nádrž. Dává se přednost posledně uvedené metodě. Je také vhodnější při použití velmi malých druhů.

Průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (r2) se graficky vynesou proti koncentraci kvůli kontrole závislosti odezvy.

K vyjádření závislosti r2 na koncentraci se zvolí vhodný model; jeho volba musí být řádně zdůvodněna.

Liší-li se pro jednotlivé nádrže počty ryb, které přežily, prokládá se vážený model s cílem zohlednit různé velikosti skupin.

Metoda proložení modelu musí umožnit odhadnout například hodnotu EC20 a stanovit její rozptyl (buď směrodatnou odchylku nebo interval spolehlivosti). Graf proloženého modelu se vynese spolu s daty, aby byla zřejmá vhodnost použitého modelu (9, 19, 20, 21).

XIV.2.1.2 Analýza výsledků pro stanovení LOEC

Bylo-li ve zkoušce použito pro každou koncentraci více nádrží, může být odhad LOEC založen na analýze variance (ANOVA) průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (viz bod 2.1) následované vhodným srovnáním průměrné hodnoty r pro každou koncentraci s průměrnou hodnotou r pro kontrolní skupiny (např. Dunnettovým nebo Williamsovým testem (13, 14, 15, 22)), aby se zjistila nejmenší koncentrace, u níž je na úrovni pravděpodobnosti 0,05 rozdíl významný. Nejsou-li předpoklady pro použití parametrických metod splněny, kvůli jinému než normálnímu rozdělení (např. se použije Shapiro-Wilkův test) nebo kvůli heterogennímu rozptylu (Bartlettův test), měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylů nebo by měla být provedena vážená ANOVA.

Není-li pro každou koncentraci počet nádrží znásoben, nebude ANOVA u jednotlivé nádrže citlivá nebo bude nemožná. V takovém případě je přijatelným kompromisem založit ANOVA na „pseudospecifické“ rychlosti růstu r3 nebo na jednotlivých rybách.

Průměrná hodnota r3 pro každou koncentraci může být poté porovnána s průměrnou hodnotou r3 pro kontrolní skupiny. Hodnotu LOEC lze poté nalézt výše uvedeným způsobem. Je třeba vzít na vědomí, že tato metoda neumožňuje zohlednit variabilitu mezi nádržemi ve větší míře, než s jakou se počítá v důsledku variability mezi rybami, a ani před ní nechrání. Ukázalo se však (9), že variabilita mezi nádržemi byla ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami) velmi malá. Nejsou-li v analýze využity jednotlivé ryby, musí být ve zprávě uvedena metoda nalezení odlehlých hodnot a její použití musí být zdůvodněno.

XIV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Výsledky je třeba interpretovat opatrně, leží-li naměřené hodnoty koncentrací toxické látky v roztocích blízko meze stanovitelnosti analytické metody, nebo klesá-li u semistatických zkoušek koncentrace zkoušené látky od okamžiku přípravy roztoku do jeho obnovení.

XIV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XIV.2.3.1 Zkoušená látka

fyzikální stav a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.

XIV.2.3.2 Testovací druh

vědecký název, podle možnosti,

kmen, velikost, původ, jakákoli příprava atd.,

XIV.2.3.3 Zkušební podmínky

použitý zkušební postup (např. semistatický/s obnovením, průtokový, nasazování, hustota obsádky atd.),

uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží, zkušební koncentrace a znásobení počtu nádrží, počet ryb v nádrži),

metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovování (je-li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),

nominální zkušební koncentrace, střední hodnota naměřených hodnot v jednotlivých nádržích, její směrodatná odchylka a metody jejich stanovení a důkazy toho, že naměřené hodnoty odpovídají koncentracím zkoušené látky v pravém roztoku,

charakteristiky ředicí vody: pH, alkalinita, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě solnost zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,

kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,

podrobné informace o krmení (např. druh krmiva (krmiv), původ, podávané množství a frekvence krmení).

XIV.2.3.4 Výsledky

doklady o tom, že kontrolní skupiny vyhověly kriteriu přežití, a data o mortalitě pro každou zkušební koncentraci,

použité metody statistické analýzy, statistiky založené na znásobeném počtu nádrží nebo na jednotlivých rybách, zpracování dat a zdůvodnění použitých metod,

— data ve formě tabulky o individuálních a středních hodnotách hmotností ryb v den 0, 14 (bylo-li prováděno vážení) a 28, hodnoty průměrných rychlostí růstu pro nádrž nebo popřípadě pseudospecifických rychlostí růstu pro intervaly 0 - 28 dnů nebo popřípadě 0 - 14 a 14 - 28 dnů,

výsledky statistické analýzy (tj. regresní analýzy nebo ANOVA) nejlépe ve formě tabulky nebo v grafické formě a hodnota LOEC (p = 0,05) a NOEC nebo ECx, popřípadě se směrodatnými odchylkami,

výskyt jakýchkoli neobvyklých reakcí ryb a viditelné účinky vyvolané zkoušenou látkou.

XIV.3 LITERATURA

(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.

(2) Meyer, A., Bierman, C. H., Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.

(3) Ashley S., Mallett M. J., Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.

(4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855-1870.

(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N., Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157-164.

(6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japonsko.

(7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N., Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 28, 287-297.

(8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W., Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.

(9) Stephan C. E., Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner, D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Filadelfie, 328338.

(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 str.

(11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.

(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10.-12. prosinec 1991.

(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

(15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc 27, 103-117.

(16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture, 120, 123-133.

(17) Quinton, J. C, Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33-41.

(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter DC in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 str.

(19) Bruce, R. D., Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

(20) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D., McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.

(21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 str.

(22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc., 28, 510-531.


DODATEK 1

DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY

DruhyDoporučený
rozsah
zkušební
teploty
(°C)
Fotoperioda
(h)
Doporučené
rozpětí
počáteční
hmotnosti ryb
(g)
Doporučená přesnost
měření
Velikost
násady
(g/l)
Hustota
obsádky
(l-1)
KrmivoDélka
zkoušky
(d)
Doporučené druhy:
Oncorhynchus mykiss
pstruh duhový
12,5-16,0 12-16 1-5 na 100 mg 1,2-2,0 4sušené krmivo
pro plůdek lososovitých
ryb
≥ 28
Jiné dobře popsané druhy:
Danio rerio
danio pruhované
21-25 12-16 0,050-0,100 na 1 mg 0,2-1,05-10 živé krmivo
(Brachionus Artemia)
≥ 28
Oryzias latipes
halančík japonský
21-25 12-16 0,050-0,100 na 1 mg 0,2-1,05-20 živé krmivo
(Brachionus Artemia)
≥ 28

DODATEK 2

NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY

LátkaKoncentrace
Nerozpuštěné látky< 20 mg/l
Celkový organický uhlík< 2 mg/l
Nedisociovaný amoniak< 1µg/1
Zbytkový chlor< 10 µg/1
Celkové organofosforové pesticidy< 50 ng/l
Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly< 50 ng/l
Celkový organický chlor< 25 ng/l

DODATEK 3

LOGARITMICKÁ ŘADA KONCENTRACÍ VHODNÁ PRO ZKOUŠKU TOXICITY (9)

Sloupec (počet koncentrací mezi 100 a 10, nebo mezi 10 a 1)(1)
1234567
100100100100100100100
32465663687275
10223240465256
3,2101825323742
1,04,61016222732
2,25,610151924
1,03,26,3101418
1,84,06,81013
1,02,54,67,210
1,63,25,27,5
1,02,23,75,6
1,52,74,2
1,01,93,2
1,42,4
1,01,8
1,3
1,0

1 Ze sloupců může být zvolena řada pěti (nebo více) po sobě jdoucích koncentrací. Mezilehlé body pro koncentrace ve sloupci (x) jsou uvedeny ve sloupci (2x + 1). Uvedené hodnoty mohou být koncentracemi vyjádřenými v objemových nebo hmotnostních procentech (mg/l nebo µg/l). Hodnoty mohou být podle potřeby násobeny nebo děleny jakoukoli mocninou 10. Řada ve sloupci 1 by mohla být použita při značné nejistotě, pokud jde stupeň toxicity.

XV. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY NA RYBÍCH EMBRYÍCH A POTĚRU - KRÁTKODOBÁ ZKOUŠKA - metoda C.15 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XV.1 METODA

Tato zkouška krátkodobé toxicity je replikou metody OECD TG 212 (1998).

XV.1.1 ÚVOD

Tato zkouška krátkodobé toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku je krátkodobou zkouškou, při níž jsou exponována životní stádia od čerstvě oplodněných jiker do stadia váčkových plůdků. Při zkoušce na embryu a na váčkovém plůdku se nekrmí, zkouška by tedy měla být ukončena dokud je váčkový plůdek stále vyživován ze žloutkového váčku.

Zkouška je určena k zjištění letálních a v omezené míře subletálních účinků chemických látek na specifická stadia a testovací druhy. Tato zkouška by měla poskytnout užitečné informace, neboť by a) mohla být přechodem mezi letálními a subletálními zkouškami, b) mohla být použita jako screeningová zkouška pro úplnou zkoušku toxicity na časných vývojových stadiích nebo pro zkoušky chronické toxicity a c) mohla by být použita pro zkoušení na druzích, u nichž nejsou dostatečně rozvinuty chovné techniky, aby pokryly období od endogenního k exogennímu vyživování.

Je třeba mít na paměti, že pouze zkoušky pokrývající celý životní cyklus ryb obecně umožňují odhadnout chronickou toxicitu chemické látky pro ryby a že jakékoli omezení expozice nějakého životního stadia může snížit citlivost a tím podhodnotit chronickou toxicitu. Očekává se tedy, že zkouška na embryu a váčkovém plůdku je méně citlivá než úplná zkouška na časných vývojových stádiích, zejména pokud jde o vysoce lipofilní chemické látky (log Po/v > 4) a chemické látky se specifickým mechanismem účinku. V citlivostech těchto dvou zkoušek se však očekávají menší rozdíly v případě chemických látek s nespecifickým, narkotickým mechanismem účinku (1).

Před publikováním této zkoušky bylo nejvíce zkušeností s touto zkouškou na embryu a váčkovém plůdku získáno u sladkovodní ryby Danio rerio. Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae - obecný název danio pruhované). Podrobnější pokyny pro zkoušku s tímto druhem jsou tedy uvedeny v dodatku 1. To nevylučuje použití jiného druhu, pro který jsou zkušenosti rovněž k dispozici (tabulky IA a IB).

XV.1.2 DEFINICE

Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05).

Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.

NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

XV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Embrya a váčkové plůdky se vystaví rozsahu koncentrací zkoušené látky rozpuštěné ve vodě. Zkouška umožňuje volit mezi semistatickým a průtokovým uspořádáním. Volba závisí na povaze zkoušené látky. Zkouška se zahájí umístěním oplodněných jiker do zkušebních nádrží a ukončí se těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku čerstvých plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Posoudí se letální a subletální účinky a porovnají se s kontrolními hodnotami s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky, tedy koncentraci bez pozorovaných účinků. Účinky mohou být eventuálně analyzovány za použití regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která způsobuje určitý procentuálně vyjádřený účinek (tj. LC/ECx, kde x je definovaný procentuální účinek).

XV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

Měly by být dostupné výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku. Výsledky mohou být užitečné při výběru vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkoušce na časných vývojových stádiích. Měly by být známy rozpustnost látky ve vodě (včetně rozpustnosti ve zkušební vodě) a tlak par látky. Měla by být k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.

Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek jsou strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pKa, Po/v a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).

XV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY

Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:

celková míra přežití oplodněných jiker v kontrolních skupinách a podle potřeby v nádržích, do nichž bylo přidáno pouze rozpouštědlo, musí být vyšší nebo rovna limitům stanoveným v dodatcích 2 a 3,

koncentrace rozpuštěného kyslíku musí ležet mezi 60 a 100 % nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,

teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi nebo den ode dne lišit o více než ± 1,5 °C a měla by být udržována v rozpětí teplot stanoveném pro zkušební druh (dodatky 2 a 3),

XV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XV.1.6.1 Zkušební nádrže

Mohou být použity jakékoli nádrže ze skla nebo z jiného inertního materiálu. Rozměry zkušebních nádrží by měly být dostatečné k tomu, aby vyhovovaly velikosti násady (viz bod 1.7.1.2). Doporučuje se, aby byly nádrže umístěny ve zkušebním prostoru náhodně. Uspořádání do náhodných bloků s možností expozice v každém bloku se upřednostňuje před zcela náhodným uspořádáním, když existují systémové účinky v laboratoři, které mohou být blokovým uspořádáním kontrolovány. Je-li použito blokové uspořádání, mělo by být zohledněno při následné analýze dat. Nádrže by měly být chráněny před nežádoucími rušivými vlivy.

XV.1.6.2 Výběr druhů ryb

Doporučené druhy ryb jsou uvedeny v tabulce 1A. To nevylučuje použití jiného druhu (příklady jsou uvedeny v tabulce 1B), zkušební postup musí být ale upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

XV.1.6.3 Chov matečných ryb

Podrobnosti o chovu matečných ryb v uspokojivých podmínkách jsou uvedeny v metodě OECD TG 210 (1) a v literatuře (2, 3, 4, 5, 6).

XV.1.6.4 Chov embryí a plůdků

Embrya a čerstvě vykulené plůdky mohou být exponovány v hlavní nádrži v menších nádobách s pletivovými stěnami nebo uzávěry, aby jimi mohl proudit zkušební roztok. Nevířivého průtoku nádobami lze dosáhnout jejich zavěšení do ramen, pomocí nichž lze pohybovat nádobami nahoru a dolů, přičemž organismy zůstanou stále ponořeny; lze rovněž použít syfonový systém přítoku a výpusti. Oplodněné jikry lososovitých ryb mohou ležet na podložce nebo pletivu s dostatečně velkými oky, aby jimi mohly plůdky po vylíhnutí propadnout. K přemístění embryí a plůdků v semistatické zkoušce s každodenní úplnou výměnou média je vhodné použít Pasteurovy pipety. (viz bod 1.6.6).

Jsou-li k udržení jiker v hlavní nádrži použity nádoby, mřížky nebo pletiva, měly by být po vylíhnutí plůdků odstraněny (1),pokud ovšem nemají být ponechány k zamezení úniku ryb. Je-li třeba plůdky přemístit, neměly by být vystaveny vzduchu a neměly by se k jejich vytažení z nádob používat síťky (taková opatrnost není nutná u méně křehkých druhů, např. u kapra). Okamžik přemístění se liší podle druhu a nemusí být vždy nutný. U semistatických technik mohou být použity kádinky nebo mělké nádobky a podle potřeby mohou být opatřeny sítem umístěným nepatrně nad dnem kádinky. Je-li objem těchto nádob dostatečný, aby vyhovoval požadavkům na nasazování (viz bod 1.7.1.2) nemusí být přemístění embryí nebo plůdků nutné.

XV.1.6.5 Voda

Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoliv voda, která vyhovuje chemickým charakteristikám přijatelné ředicím vody, jak jsou uvedeny v dodatku 4 a v níž testovací druhy kontrolních skupin přežívají alespoň tak, jak je uvedeno v dodatcích 2 a 3. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. pH by se nemělo měnit o více než ± 0,5. Pro ujištění, že ředící voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkoušenou látkou) nebo nepříznivý vliv na stav matečných ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).

XV. 1.6.6 Zkušební roztoky

Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.

Zásobní roztok by měl být nejlépe připraven jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním a sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony. Neměla by být používána rozpouštědla nebo dispergátory (solubilizační činidla), v některých případech však může být použití takových látek pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na přežití ani viditelné nepříznivé účinky na časná vývojová stádia, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu. Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.

U semistatických technik mohou být použity dva různé postupy obměny; buď i) se do čistých nádob připraví nové zkušební roztoky a přežívající jikry a plůdky se s malým objemem starého roztoku opatrně přemístí do nových nádob, aniž by se vystavily vzduchu, nebo ii) se testovací organismy ponechají v nádobě a vymění se určitý podíl (alespoň tři čtvrtiny) zkušební vody. Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat médium denně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 - 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška. V každém případě je třeba dbát na to, aby plůdky nebyly při obnovování vody vystaveny stresu.

Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Jako vhodný by shledán průtok zajišťující výměnu alespoň pěti objemů nádrže za 24 h (2).

XV.1.7 POSTUP

Užitečné informace o provádění zkoušek toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku jsou dostupné v literatuře, přičemž některé literární zdroje (7, 8, 9) jsou uvedeny v tomto textu v oddílu s literaturou.

XV.1.7.1 Podmínky expozice

XV.1.7.1.1 Délka expozice

Zkouška se zahájí nejlépe do 30 minut po oplodnění jiker. Embrya se ponoří do zkušebního roztoku před započetím rýhování blastuly, nebo co nejdříve po něm, a v každém případě před počátkem stádia gastruly. U jiker získaných od komerčního dodavatele nemusí být možné zahájit zkoušku ihned po oplodnění. Vhledem k tomu, že citlivost zkoušky může být závažně ovlivněna zpoždění začátku zkoušky, měla by být zkouška zahájena do osmi hodin po oplodnění. Vzhledem k tomu, že se plůdky v průběhu expozice nekrmí, ukončí se zkouška těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku u plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Délka zkoušky bude záviset na použitém druhu. Některé doporučené délky zkoušky jsou uvedený v dodatcích 2 a 3.

XV.1.7.1.2 Nasazování

Počet oplodněných jiker na začátku zkoušky by měl být dostatečný ke splnění statistických požadavků. Měly by být k expozici náhodně rozděleny a na jednu koncentraci by mělo být rozděleno alespoň 30 jiker rovným dílem (nebo alespoň jak je to jen možné s ohledem na to, že u některých druhů může být obtížné získat stejně velké podíly) mezi alespoň tři další zkušební nádrže. Velikost násady (biomasa v jednotce objemu) by měla být tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. U průtokových zkoušek se doporučuje nasazování nepřekračující 0,5 g/l za 24 h a v žádném okamžiku nepřekračující 5 g/l roztoku (2).

XV.1.7.1.3 Světlo a teplota

Fotoperioda a teplota zkušební vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatky 2 a 3). Pro sledování teploty může sloužit další zkušební nádrž.

XV.1.7.2 Zkušební koncentrace

Obvykle je nezbytných pět koncentrací zkoušené látky lišících se od sebe faktorem nepřekračujícím 3,2. Při výběru rozsahu zkušebních koncentrací by měla být zohledněna křivka závislosti hodnoty LC50 na délce expozice ve studii akutní toxicity. Za určitých okolností může být oprávněné použít méně než pět koncentrací, např. v limitní zkoušce, a užší rozsah koncentrací. Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Koncentrace látky, které jsou vyšší než 96hodinová LC50 nebo vyšší než 100 mg/l, podle toho, co je nižší, nemusí být zkoušeny. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušební vodě.

Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo (viz bod 1.6.6), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádrži vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná.

XV.1.7.3 Kontrolní skupiny

Jako další zkušební sady by měly být nasazeny kontrolní skupina v ředicí vodě (příslušným způsoben znásobená) a podle potřeby také jedna kontrolní skupina se solubilizačním činidlem (příslušným způsoben znásobená).

XV.1.7.4 Častost analytických stanovení a měření

Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky stanovují v pravidelných intervalech.

U semistatických zkoušek, pokud se předpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 %, viz bod 1.4 a 1.6.6), se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením alespoň v nejméně třech nádržích (tj. analýzy se provedou na vzorku téhož roztoku - ihned po jeho přípravě a při jeho výměně).

U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) předpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí větším než ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkoušené koncentrace ihned po jejich přípravě a před jejich výměnou, a to stejně často (tj. alespoň ve třech okamžicích rovnoměrně rozložených přes celkovou dobu zkoušky). Stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením je třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádrže. Stanovení se provádějí v odstupu ne více než 7 dnů. Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky bylá koncentrace uspokojivě udržována v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách.

Pro průtokové zkoušky je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Je-li zkouška delší než sedm dnů, doporučuje se zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé.

Může být nezbytné vzorky odstředit nebo filtrovat (např. přes filtr s velikostí pórů 0,45 µm). Vzhledem k tomu, že však odstředění ani filtrace vždy neoddělí od sebe biologicky dostupný a biologicky nedostupný podíl zkušební látky, nemusí být vzorky takto zpracovány.

V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost a solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u semistatických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří denně, nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.

XV.1.7.5 Pozorování

XV.1.7.5.1 Stádia vývoje embrya

Embryonální stádium (tj. stadium gastruly) na začátku expozice zkoušené látce by mělo být identifikováno co nejpřesněji. Lze to provést za použití reprezentativního vzorku vhodně uchovávaných a očištěných jiker. Popis a vyobrazení embryonálních stádií lze také nalézt v literatuře (2, 5, 10, 11).

XV.1.7.5.2 Líhnutí a přežívání

Líhnutí a přežívání se pozoruje alespoň jednou denně a zaznamenávají se počty. Může být žádoucí provádět na začátku zkoušky častější pozorování (např. každých 30 min během prvních tří hodin), neboť v některých případech mohou být důležitější doby přežití než pouhé počty úhynů (např. dochází-li k akutním toxickým účinkům). Uhynulá embrya a plůdky se odstraní ihned po nalezení, neboť se rychle rozkládají. Při odstraňování uhynulých jedinců se postupuje s mimořádnou opatrností, aby se nezasáhlo do sousedních jiker/plůdků nebo aby se tyto fyzicky nepoškodily, neboť jsou mimořádně subtilní a citlivé. Kritéria uhynutí se u životních stádií liší:

u jiker: zejména v časných stádiích zřetelná ztráta průsvitnosti a změna ve zbarvení vyvolané koagulací a/nebo sražením bílkovin vedoucími k bílému zakalení,

u embryí: absence pohybu nebo tepu srdce nebo neprůsvitné zbarvení u druhů, jejichž embrya jsou za normálních okolností průsvitná,

u plůdků: nepohyblivost nebo absence dýchacích pohybů nebo tepu srdce nebo bílé neprůsvitné zbarvení centrálního nervového systému a nedostatečná reakce na mechanické podněty.

XV.1.7.5.3 Neobvyklý vzhled

Počet plůdků vykazujících neobvyklý tělesný vzhled nebo pigmentaci a stav absorpce žloutkového váčku se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky a na povaze popisované odchylky. Je třeba si uvědomit, že neobvyklá embrya a plůdky se přirozeně vyskytují a u některých druhů jich může být v kontrolních skupinách řádově několik procent. Neobvyklí jedinci by měli být ze zkušební nádrže odstranění pouze v případě uhynutí.

XV.1.7.5.4 Neobvyklé chování

Odchylky, např. hyperventilace, nekoordinované plavání a netypická nečinnost se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky. Tyto účinky, přestože je obtížné je kvantifikovat, mohou -jsou-li pozorovány - napomoci interpretovat data o mortalitě, tj. mohou poskytnout informace o mechanismu toxického působení látky.

XV.1.7.5.5 Tělesná délka

Na konci zkoušky se doporučuje změřit individuální délku: může být změřena standardní délka, délka těla (the fork lenght) nebo celková délka. Došlo-li však k uhnití ocasní ploutve nebo k erozi ploutví, použije se standardní délka. Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro délku mezi jednotlivými kontrolními skupinami ≤ 20 %.

XV.1.7.5.6 Hmotnost

Na konci se zkoušky lze stanovit jednotlivé hmotnosti; hmotnost za sucha (24 h při 60 °C) se upřednostňuje před živou váhou (po osušení do sucha). Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro hmotnost mezi jednotlivými kontrolními skupinami ≤ 20 %.

Tato pozorování povedou k některým nebo ke všem následujícím údajům, které budou k dispozici pro statistickou analýzu:

kumulativní mortalita,

počet zdravých plůdků na konci zkoušky,

čas začátku líhnutí a konce líhnutí (tj. 90% vylíhnutí v každé paralelní skupině),

počet plůdků vylíhnutých každý den,

délka (a hmotnost) ryb, které přežily do konce zkoušky,

počet plůdků, které jsou deformované nebo mají neobvyklý vzhled,

počet plůdků vykazujících neobvyklé chování.

XV.2 DATA A ZPRÁVY

XV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, ve výchozím počtu oplodněných jiker v měřených parametrech. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.

Mají-li být odhadnuty hodnoty LOEC/NOEC, bude nezbytné analyzovat odchylky pro každou sadu paralelních skupin pomocí analýzy variance (ANOVA) nebo pomocí kontingenční tabulky. K vícenásobnému porovnání výsledků pro jednotlivé koncentrace a pro kontrolní skupiny může být užitečný Dunnettův test (12, 13). K dispozici jsou další užitečné příklady (14, 15). Vypočte se a uvede stupeň účinku, který lze prokázat pomocí ANOVA nebo jiných metod (tj. vypovídací schopnost zkoušky). Je třeba si uvědomit, že ne všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6 jsou vhodná pro statistickou analýzu pomocí ANOVA. Například kumulativní mortalita a počet zdravých plůdků na konci zkoušky by mohly být analyzovány probitovými metodami.

Mají-li být odhadnuty LC nebo ECx, proloží se daty vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka nebo křivky by měly být tak parametrizovány, aby bylo možné přímo odhadnout požadované hodnoty LC nebo ECx a jejich směrodatné odchylky. To značně usnadňuje výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnoty LC nebo ECx. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. Proložení lze provést graficky. Regresní analýza je vhodná pro všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6.

XV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že se naměřené koncentrace toxické látky ve zkušebních roztocích pohybují na úrovních blízkých mezi stanovitelnosti analytické metody. Interpretace výsledků pro koncentrace vyšší než je rozpustnost látky ve vodě by měla být rovněž opatrná.

XV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XV.2.3.1 Zkoušená látka

fyzikální stav a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.

XV.2.3.2 Testovací druh

vědecký název, kmen, počet matečných ryb (tj. kolik samiček bylo ve zkoušce použito pro opatření požadovaného počtu jiker), zdroj a metoda sběru oplodněných jiker a následné zpracování.

XV.2.3.3 Zkušební podmínky

použitá zkušební metoda (např. semistatická nebo průtoková metoda, doba od oplodnění do začátku zkoušky, nasazování atd.),

fotoperioda (fotoperiody),

uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží a jejich znásobení, počet embryí v nádrži),

metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (je-li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),

nominální zkušební koncentrace, naměřené hodnoty ve zkušebních nádržích, jejich střední hodnoty a směrodatné odchylky á metody jejich stanovení a je-li zkoušená látka rozpustná ve vodě v koncentracích nižších, než jsou vyšetřované koncentrace, uvede se důkaz toho, že naměřené koncentrace odpovídají koncentraci zkoušené látky v roztoku,

charakteristiky ředicí vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,

kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku.

XV.2.3.4 Výsledky

výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,

doklady o tom, že kontrolní skupiny splnily obecné požadavky na přijatelnost přežití pro testovací druh (dodatky 2 a 3),

údaje o mortalitě nebo přežití v embryonálním stádiu a ve stádiu plůdku a údaje o celkové mortalitě nebo přežití,

doba do vylíhnutí, počet vylíhnutých jedinců,

údaje o délce (a hmotnosti),

výskyt a popis morfologických odchylek, pokud se vyskytly,

výskyt a popis účinků na chování, pokud se vyskytly,

statistická analýza a zpracování dat,

u zkoušek analyzovaných pomocí ANOVA nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p = 0,05 a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) pro každou posuzovanou reakci, včetně popisu použité statistické metody a údaje o tom, jak velký účinek bylo možné odhalit,

u zkoušek analyzovaných pomocí regresních metod, hodnoty LC a ECx a intervaly spolehlivosti a graf proloženého modelu použitého pro jejich výpočet,

vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.

XV.3 LITERATURA

(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 str., červen 1990.

(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 str.

(3) Brauhn J. L., Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. str. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

(4) Brungs W. A., Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. str. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121-173.

(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328-330.

(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B., Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environ. Toxicol Chem., 6, 61-71.

(8) Birge J. W., Black J. A., Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environ. Toxicol. Chem., 4, 807-821.

(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A., Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145.

(10) Kirchen R. V., W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.

(11) Kirchen R. V., W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 str.

(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H., Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Filadelfie.

(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M., Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321-334.

(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Eariy Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, prosinec 1992, 81 str.

(17) Dave G., Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2.1, 126-134.

(18) Meyer A., Bierman C. H., Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology - an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236.

(19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F., Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicol. Environ. Safety, 32, 19-28.

(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, prosinec. 1991, EPA, Duluth.

(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H., Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1189-1203.

(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 str.

(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, v: W. S. Hoar, D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1-58.

TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku

Sladkovodní
Oncorhynchus mykiss
pstruh duhový (9, 16)
Danio rerio
danio pruhované (7, 17, 18)
Cyprinus caprio
kapr obecný (8, 19)
Oryzias latipes
halančík japonský (20, 21)
Pimephales promelas
střevle (8, 22)

TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity

SladkovodníMořské
Carassius auratus
karas zlatý (8)
Menidia peninsulae
(23, 24, 25)
Lepomis macrochirus
slunečnice modrá (8)
Clupea harengus
sleď (24, 25)
Gadus morhua
treska (24, 25)
Cyprinodon variegatus
(23, 24, 25)

DODATEK 1

NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO)

ÚVOD

Danio pruhované pochází z indického pobřeží Coromandel, kde žije v bystřinách. Je běžnou akvarijní rybou z čeledi kaprovitých. Informace o péči o něj a o jeho chovu jsou uvedeny v standardních příručkách o tropických rybách. Přehled jeho biologie a použití ve výzkumu ryb podává Laale (1).

Ryba zřídka dorůstá délky více než 45 mm. Má válcové tělo se 7 - 9 horizontálními tmavě modrými stříbřitými pruhy. Pruhy pokračují přes ocasní a řitní ploutve. Hřbet má olivově zelený. Samečci jsou štíhlejší než samičky. Samičky jsou stříbrnější a mají rozšířené břicho, zejména před třením.

Dospělé ryby dokáží snášet velké kolísání teploty, pH a tvrdosti vody. Mají-li se získat zdravé ryby poskytující jikry dobré kvality, měly by být zajištěny optimální podmínky.

Při tření sameček sleduje samičku, doráží na ni a při vypuzení jiker je oplodní. Jikry, které jsou průsvitné a nejsou přilnavé, dopadají na dno, kde mohou být pozřeny rodiči. Na tření má vliv světlo. Při odpovídajícím ranním světle se ryby třou v prvních hodinách po rozednění.

Samička může klást v odstupu jednoho týdne dávky o několika tisících jiker.

PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA

Vybere se vhodný počet zdravých ryb, které se alespoň dva týdny před předpokládaným třením udržují ve vhodné vodě (např. dodatek 4). Skupiny ryb by měly mít možnost se před kladením jiker pro zkoušku alespoň jednou vytřít. Hustota obsádky ryb by v tomto období neměla přesáhnout 1 gram ryb na litr. Pravidelná výměna vody nebo použití přečišťovacího systému umožní obsádku zvýšit. Teplota v chovných nádržích se má udržovat na 25 ± 2 °C. Ryby by měly dostávat rozmanitou stravu, která může obsahovat například komerční suché krmivo, čerstvě vylíhnuté Arthemia, chironomidy, dafnie, bílé červy (Enchytraeids).

Dále jsou uvedeny dvě metody, které v praxi vedly k získání dostatečného množství zdravých oplodněných jiker pro provedení zkoušky:

i) Osm samiček a 16 samečků se umístí do nádrže obsahující 50 litrů ředicí vody, chráněné před přímým světlem a ponechají se alespoň 48 h co nejvíce v klidu. Na dno nádrže se odpoledne v den před započetím zkoušky umístí podložka pro tření. Podložka pro tření se skládá z 5 - 7 mm vysokého rámu (z plexiskla nebo jiného vhodného materiálu) s 2 - 5mm hrubým roštem nahoře a s 10 - 30µm jemným roštem vespod. Na hrubém roštu je připevněn třecí substrát vyrobený z nylonových vláken. Poté co byly ryby drženy 12 h v temnu se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Dvě až čtyři hodiny po vytření se podložka pro tření vyjme a jikry se seberou. Podložka pro tření zabrání rybám v požírání jiker a zároveň umožní snadný sběr jiker. Skupiny ryb by se měly před třením určeným k produkci jiker pro zkoušku vytřít alespoň jednou.

ii) Pět až deset samečků a samiček se alespoň dva týdny před zamýšleným třením chová odděleně. Po 5 až 10 dnech se břicha samiček rozšíří a zviditelní se jejich pohlavní papily. Samečci papily nemají. Tření se provede v třecích nádržích opatřených falešným dnem z pletiva (jako výše). Nádrž se naplní ředicí vodou tak, aby voda sahala 5 - 10 cm nad rošt. Jedna samička a dva samečci se umístí do nádrže den před zamýšleným třením. Teplota vody se postupně zvýší jeden stupeň nad aklimatizační teplotu. Vypne se osvětlení a nádrž se ponechá co nejvíce v klidu. Ráno se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Po 2 - 4 h se ryby vyjmou a jikry se seberou. Je-li potřeba více dávek jiker, než lze získat od jedné samičky, nasadí se paralelně dostatečný počet třecích nádrží. Zaznamenáním reprodukční úspěšnosti (množství a kvality) jednotlivých samiček před zkouškou, lze vybrat pro chov samičky s nejvyšší úspěšností.

Jikry se přenesou do zkušebních nádrží skleněnou trubičkou (o vnitřním průměru ne menším než 4 mm) opatřenou pružným nasávacím balónkem. Množství vody, které se přenáší s jikrami, by mělo být co nejmenší. Jikry jsou těžší než voda a z trubičky vypadnou do vody. Je třeba zabránit tomu, aby jikry (a plůdky) přišly do kontaktu se vzduchem. Mikroskopickým vyšetřením vzorku (vzorků) jiker se ověří, že v prvních stádiích vývoje nedošlo k nepravidelnostem. Desinfekce jiker není přípustná.

Mortalita jiker je nejvyšší během prvních 24 h po oplodnění. V této době je často pozorována mortalita 5 - 40 %. Jikry degenerují v důsledku neúspěšného oplodnění nebo vývojových vad. Zdá se, že kvalita dávek jiker závisí na samičce, neboť některé samičky soustavně kladou jikry dobré kvality, jakou jiné samičky neposkytují. Rovněž rychlost vývoje a líhnutí se mezi snůškami liší. Úspěšně oplodněné jikry a plůdky se žloutkovým váčkem přežívají dobře, obvykle jich přežívá více než 90 %. Při 25 °C se z jiker líhnou jedinci po 3 - 5 dnech po oplodnění a žloutkový váček je absorbován přibližně po 13 dnech po oplodnění.

Embryonální vývoj byl dobře popsán Hisaokou a Battlem (2). Díky průsvitnosti jiker a plůdků čerstvě po vylíhnutí lze vývoj ryb dobře sledovat a lze pozorovat malformace. Přibližně čtyři hodiny po vytření lze rozlišit neoplodněné jikry od oplodněných (3). K tomuto vyšetření se jikry a plůdky umístí do nádobky o malém objemu a prohlížejí se pod mikroskopem.

Zkušební podmínky požadované pro časná vývojová stádia jsou uvedena v dodatku 2. Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7,8 a 250 mg/l, vyjádřeno jako CaCO3.

VÝPOČTY A STATISTIKA

Navrhuje se dvoufázový přístup. V první fázi se statisticky analyzují data o mortalitě, nenormálním vývoji a době líhnutí. Poté se pro ty koncentrace, při nichž nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky na tyto parametry, statisticky vyhodnotí tělesná délka. Tento přístup se doporučuje, neboť toxická látka může selektivně usmrcovat menší ryby, prodlužovat dobu líhnutí a indukovat makroskopické malformace a tedy zkreslovat délku. Kromě toho tak bude pro každou expozici měřen zhruba stejný počet ryb, čímž se zajistí validita statistiky zkoušky.

STANOVENÍ LC50 a EC50

Procento přežití jiker a čerstvých plůdků se vypočte a zkoriguje na mortalitu v kontrolních skupinách podle Abbottovy rovnice (4):

C − P´
P = 100 − ———× 100
C

kde:

P = korigované procento přežití

P´ = procento přežití pozorované ve zkušební koncentraci

C = procento přežití v kontrolní skupině

Podle možnosti se vhodnou metodou stanoví hodnota LC50 na konci zkoušky.

Požaduje-li se, aby byly do statistiky pro EC50 zahrnuty morfologické odchylky, lze k tomu nalézt návod v práci Stephana (5).

ODHAD LOEC A NOEC

Cílem zkoušky na jikrách a váčkových plůdcích je porovnat koncentrace, u nichž byl pozorovatelný účinek, s kontrolními skupinami, tj. stanovit LOEC. Použije se tedy metoda vícenásobného srovnání (6, 7, 8, 9, 10).

LITERATURA

(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173.

(2) Hisaoka K. K., Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), J. Morph., 102, 311 str.

(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrab‰orbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). J. Appl. Ichthyol., 2, 173-181.

(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1-333.

(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster, W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69-81.

(6) Dunnett C. W. (1955). Á Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc, 27, 103-117.

(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc 28, 519-531.

(10) Sokal R. R., Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman, Co., San Francisco.


DODATEK 2

ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY

DruhTeplota
(°C)
Salinita (‰)Fotoperioda (h)Délka stádií (d)Typická délka zkouškyPřežití v kontrolních skupinách
(minimální hodnota v %)
EmbryoVáčkový plůdekÚspěšnost líhnutíPo vylíhnutí
SLADKOVODNÍ
Brachydanio rerio Danio
pruhované
25 ± 112-163-58-10Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
5 dnů po vylíhnutí (8 - 10 dnů)
8090
Oncorhynchus mykiss
Pstruh duhový
10 ± 1 (1)
12 ± 1(2)
0(3)30-3525-30Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
20 dnů po vylíhnutí (50 - 55 dnů)
6670
Cyprinus carpio
Kapr obecný
21-2512-165> 4Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů)
8075
Oryzias latipes
Halančík japonský
24 ± 1 (1)
2-3 ± 1 (2)
12-168-114-8Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly ) do
5 dnů po vylíhnutí (13 - 16 dnů)
8080
Pimephales promelas
Střevle
25 ± 2164-55Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů)
6070

1 Pro embrya.

2 Pro plůdky.

3 Temno pro embrya a plůdky do jednoho týdne po vylíhnutí, s výjimkou okamžiků prohlídky. Poté po dobu zkoušky tlumené světlo.


DODATEK 3

ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY

DruhTeplota
(°C)
Salinita
(‰)
Fotoperioda
(h)
Délka stádií
(d)
Typická délka zkouškyPřežití v kontrolních
skupinách
(minimální hodnota v %)
EmbryoVáčkový plůdekÚspěšnost líhnutíPo vylíhnutí
SLADKOVODNÍ
Carassius auratus
karas zlatý
24 ± 13-4> 4Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
4 dnů po vylíhnutí (7 dnů)
80
Leopomis macrochirus
slunečnice modrá
21 ± 1163> 4Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
4 dnů po vylíhnutí (7 dnů)
75
MOŘSKÝ
Menidia peninsulae22-2515-22121,510Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
5 dnů po vylíhnutí (6 - 7 dnů)
8060
Clupea harengus
Sleď
10± 18-151220-253-5Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
3 dnů po vylíhnutí (23 - 27 dnů)
6080
Gadus morhua
Treska
5± 15-301214-163-5Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
3 dnů po vylíhnutí (18 dnů)
6080
Cyprinodon variegatus25 ± 115-3012Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
4/7 dnů po vylíhnutí (28 dnů)
> 7580

DODATEK 4

NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY

LátkaKoncentrace
Nerozpuštěné látky< 20 mg/l
Celkový organický uhlík< 2 mg/l
Nedisociovaný amoniak< 1 µg/l
Zbytkový chlor< 10 µg/l
Celkové organofosforové pesticidy< 50 ng/l
Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly< 50 ng/l
Celkový organický chlor< 25 ng/l

XVI. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU - metoda C.16 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XVI.1 METODA

Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 213 (1998).

XVI.1.1 ÚVOD

Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení orální akutní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.

Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní orální toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní orální toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků.

K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

XVI.1.2 DEFINICE

Akutní orální toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od orálního podání jedné dávky zkoušené látky.

Dávka: je množství požité zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje hmotností (µg) zkoušené látky na jeden testovací organismus (µg na včelu). Skutečnou dávku u každé včely nelze vypočítat, neboť se včely krmí kolektivně. Lze však odhadnout průměrnou dávku (celkové požité množství zkoušené látky dělené počtem včel v klícce).

LD50 (střední letální dávka) orálně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po orálním podáním způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD50 se vyjadřuje v µg zkoušenou látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.

Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, jeli zcela nepohyblivý.

XVI.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozptýlené do cukerného roztoku. Včely jsou poté krmeny stejným roztokem neobsahujícím zkoušenou látku. Mortalita se zaznamenává denně během alespoň 48 hodin a porovnává se s kontrolními hodnotami. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD50 pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

XVI.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY

Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:

průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,

LD50 pro referenční látku odpovídá předpokládané hodnotě .

XVI.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XVI.1.5.1 Včelstvo

Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

XVI.1.5.2 Podmínky chovu a krmení

Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. měla by poskytovat dostatek prostoru.

Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 - 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l-1 (50% (m/V)). Po podání zkušební dávky se podává potrava podle libosti. Systém krmení by měl umožňovat zaznamenání příjmu potravy pro každou klícku (viz bod 1.6.3.1). Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

XVI.1.5.3 Příprava včel

Shromážděné včely se náhodně rozdělí do klícek, které se náhodně umístí v experimentální místnosti.

Před začátkem zkoušky mohou včely až 2 h hladovět. Doporučuje se, aby nebyla včelám před expozicí podávána potrava, aby byly na začátku zkoušky rovnocenné, pokud jde o obsah zažívacího ústrojí. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

XVI.1.5.4 Příprava dávek

Je-li zkoušená látka mísitelná s vodou, může být rozptýlena přímo v 50% cukerném roztoku. U technických přípravků a látek s nízkou rozpustností ve vodě mohou být použita vehikula, jakou jsou organická rozpouštědla, emulgátory nebo dispergátory s nízkou toxicitou pro včely (např. aceton, dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Koncentrace vehikula závisí na rozpustnosti zkoušené látky a měla by být stejná pro všechny zkoušené koncentrace. Obecně je přiměřená 1% koncentrace vehikula a neměla by být překračována.

Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. Použijí-li se k rozpuštění zkoušené látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a cukerný roztok s rozpouštědlem/nosičem v koncentraci použité v dávkách.

XVI.1.6 POSTUP

XVI.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny

Počet zkoušených dávek a jejich opakování by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD50 na úrovni spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD50. Ředicí faktor a počet koncentrací pro dávkování se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné koncentrace pro dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.

Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Nasadí se také zkušební skupiny pro použité rozpouštědlo nebo nosič (viz bod 1.5.4).

XVI.1.6.2 Referenční látka

V rámci zkušebních skupin se použije referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD50. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po deseti včelách. Přednostní referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD50, 24 h, orálně v rozmezí 0,10 - 0,35 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

XVI.1.6.3 Expozice

XVI.1.6.3.1 Podávání dávek

Každé zkušební skupině včel se podá 100 - 200 µl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné koncentraci. Větší objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, neboť v cukerném roztoku musí být použit větší podíl. Sleduje se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou. Po spotřebování potravy (obvykle do 3 - 4 h) se z klícky odebere krmicí zařízení a nahradí se krmicím zařízením obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté podává podle libosti. U některých sloučenin může vést odmítnutí potravy s vysokými koncentracemi k tomu, že je spotřebováno málo potravy nebo že se nespotřebuje žádná potrava. Po maximálně 6 h se nespotřebovaná potrava se zkoušenou látkou nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou (např. měřením objemu nebo zvážení nespotřebované stravy).

XVI. 1.6.3.2 Délka zkoušky

Zkouška trvá 48 h od okamžiku, kdy byl zkušební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Vzroste-li mortalita během prvních 24 h o 10 %, zkouška se prodlouží na 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekročí 10 %.

XVI.1.6.4 Pozorování

Mortalita se zaznamená po 4 h od zahájení zkoušky a poté po 24 h a 48 h (rozumí se po podání dávky). Jeli nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.

Odhadne se množství spotřebované potravy. Porovnáním rychlostí spotřebování potravy se zkoušenou látkou a bez ní lze získat informaci o přijatelnosti potravy se zkoušenou látkou. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

XVI.1.6.5 Limitní zkouška

V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD50 je vyšší než tato hodnota. Při ní se postupuje stejným způsobem, tj. nasadí se tři paralelní zkušební skupiny pro každou zkušební koncentraci, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spotřebované potravy s účinnou látkou a použije se referenční látka. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

XVI.2 DATA A ZPRÁVY

XVI.2.1 DATA

Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-odezva pro každý čas pozorování a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD50) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu ve. kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). Pokud nebyla potrava zcela spotřebována, stanoví se spotřebovaná dávka zkoušené látky na skupinu. LD50 se vyjádří v µg zkoušené látky na včelu.

XVI.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XVI.2.2.1 Zkoušená látka

fyzikální stav a relevantní fyzikálněchemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),

údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).

XVI.2.2.2 Testovací druh

vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru včel, datum výběru,

  informace o včelstvech použitých pro výběr testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.

XVI.2.2.3 Zkušební podmínky

teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,

podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,

metody přípravy zásobních a zkušebních roztoků (jeli použito, uvede se rozpouštědlo a jeho koncentrace),

metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jeli použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),

uspořádání zkoušky, např. použité zkušební koncentrace a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou koncentraci a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,

datum zkoušky.

XVI.2.2.4 Výsledky

výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,

primární údaje: mortalita pro každou zkoušenou koncentraci v každém čase pozorování,

graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky,

hodnoty LD50 s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování a to pro zkoušenou látku a pro referenční látku,

statistické metody použité pro stanovení LD50,

mortalita v kontrolních skupinách,

jiné pozorované nebo naměřené biologické účinky, např. neobvyklé chování včel (včetně odmítnutí zkušební dávky), rychlost spotřebování potravy v exponovaných a neexponovaných skupinách,

jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu a jiné důležité informace.

XVI.3 LITERATURA

(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products -Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 - 165. březen 1993.

(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference Compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 - 1992. J. Apicultur. Res. 22, str. 119 - 125.

(3) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharm. Exper. Ther., 96, str. 99 - 113.

(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 - 267.

XVII. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU - metoda C.17 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XVII.1 METODA

Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 214 (1998).

XVII.1.1 ÚVOD

Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení akutní kontaktní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.

Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní kontaktní toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní kontaktní toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků. K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

XVII.1.2 DEFINICE

Akutní kontaktní toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od lokální aplikace jedné dávky zkoušené látky.

Dávka: je množství aplikované zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje v hmotnosti (µg) zkoušené látky na jednoho zkušebního živočicha (µg na včelu).

LD50 (střední letální dávka) kontaktně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po kontaktní aplikaci způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD50 se vyjadřuje v µg zkoušené látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.

Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, je-li zcela nepohyblivý.

XVII.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozpuštěné ve vhodném nosiči přímou aplikací na hrudník (jako kapičky). Zkouška trvá 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Mortalita se zaznamenává denně a porovnává se s kontrolními hodnotami. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD50 pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

XVII.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY

Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:

průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,

LD50 pro referenční standard odpovídá specifikovanému rozsahu.

XVII.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

XVII.1.5.1 Výběr včel

Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

XVII.1.5.2 Podmínky chovu a krmení

Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. klícky by měly poskytovat dostatek prostoru. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách.

Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 - 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l-1 (50% (m/V)) a podává se za použití včelího krmítka po dobu zkoušky podle libosti. Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

XVII.1.5.3 Příprava včel

Shromážděné včely mohou být za účelem aplikace zkušební látky narkotizovány oxidem uhličitým nebo dusíkem. Množství anestetika v době expozice by mělo být minimalizováno. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

XVII.1.5.4 Příprava dávek

Zkušební látka se aplikuje jako roztok v nosiči, tj. v organickém rozpouštědle nebo ve vodě se smáčedlem. Jako organické rozpouštědlo se upřednostňuje aceton, mohou však být použity i jiná rozpouštědla s nízkou toxicitou pro včely (např. dimethylformamid, dimethylsulfoxid). U formulovaných přípravků dispergovaných ve vodě a u silně polárních organických látek nerozpustných v organických nosičových rozpouštědlech lze aplikaci usnadnit jejich rozpuštění ve slabém roztoku komerčního smáčedla (např. smáčedla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).

Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí-li se k rozpuštění zkušební látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a roztok s rozpouštědlem/nosičem.

XVII.1.6 POSTUP

XVII.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny

Počet zkoušených dávek a jejich paralelních experimentů by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD50 na hladině spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD50. Počet dávek se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.

Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách.

Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Je-li použito organické rozpouštědlo nebo smáčedlo, zařadí se další tři kontrolní skupiny po 10 včelách pro rozpouštědlo a smáčedlo.

XVII.1.6.2 Referenční látka

V rámci zkušebních skupin musí být použita referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD50. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po 10 včelách. Upřednostňovanou referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD50, 24 h, kontaktně v rozmezí 0,10 - 0,30 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

XVII.1.6.3 Expozice

XVII.1.6.3.1 Podávám dávek

U narkotizovaných včel se jednotlivě provede lokální aplikace. Včely se náhodně rozdělí do různých zkušebních a kontrolních skupin. Objem 1 µl roztoku obsahující zkušební látku ve vhodné koncentraci se aplikuje mikroaplikátorem na zádovou oblast hrudníku každé včely. Mohou být použity i jiné objemy, je-li to opodstatněné. Po aplikaci se včely umístí do zkušebních klícek a zásobí se cukerným roztokem.

XVII.1.6.3.2 Délka expozice

Zkouška má trvat nejlépe 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h, pokud kontrolní mortalita nepřekračuje 10 %.

XVII.1.6.4 Pozorování

Mortalita se zaznamená po 4 h od aplikace a poté po 24 h a 48 h. Je-li nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.

Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

XVII.1.6.5 Limitní zkouška

V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD50 je vyšší než tato hodnota. Postupuje se stejným způsobem, včetně nasazení tří paralelních zkušebních skupin pro každou zkušební dávku, odpovídajících kontrolních skupin a použití referenční látky. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

XVII.2. DATA A ZPRÁVY

XVII.2.1 DATA

Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-reakce pro každý čas pozorování (tj. 24 h, 48 h a podle potřeby 72 h, 96 h) a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD50) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). LD50 se vyjádří v µg zkušební látky na včelu.

XVII.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

XVII.2.2.1 Zkoušená látka

fyzikální stav a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),

údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).

XVII.2.2.2 Testovací druh

vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru shromáždění včel, datum výběru,

informace o včelstvech použitých pro shromáždění testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.

XVII.2.2.3 Zkušební podmínky

teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,

podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,

metody aplikace zkoušené látky, např. použité nosně rozpouštědlo, aplikovaný objem zkušebního roztoku, použité anestetikum,

uspořádání zkoušky, např. použité zkušební dávky a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou dávku a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,

datum zkoušky.

XVII.2.2.4 Výsledky

výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,

primární data: data: mortalita pro každou zkoušenou dávku v každém čase pozorování,

graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky;

hodnoty LD50 s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování, a to pro zkoušenou látku a referenční látku,

statistické metody použité pro stanovení LD50,

mortalita v kontrolních skupinách,

jiné pozorované nebo změřené biologické účinky a jakékoli neobvyklé reakce včel,

jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu metody a jiné důležité informace.

XVII.3 LITERATURA

(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products -Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 - 165. March 1993.

(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 - 1992. J. Apicultur. Research 22, str. 119 - 125.

(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 96, str. 99 - 113.

(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 - 267.

XVIII. METODA PRO STANOVENÍ ADSORPCE/ DESORPCE V ROVNOVÁŽNÉM STAVU - metoda C.18 podle přílohy směrnice 2001/59/ES

XVIII.1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 106 pro stanovení půdní adsorpce/desorpce násadovou rovnovážnou metodou (Batch Equilibrium Method) (2000).

XVIII.1.1 ÚVOD

Tato metoda se opírá o okružní testy a seminář o výběru půd pro vývoj zkoušky adsorpce (1, 2, 3, 4) a rovněž o existující národní metodiky (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).

Studie adsorpce/desorpce jsou užitečné pro získávání důležitých informací o mobilitě a distribuci chemických látek v půdních, vodních a vzdušných složkách biosféry (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Informace lze použít k předpovědi nebo např. odhadu dostupnosti chemické látky pro rozklad, (22, 23), transformace a příjmu organismy (24), vymývání půdním profilem, (16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28); těkání z půdy (21, 29, 30); odtoku z půdního povrchu do vod (18, 31, 32). Data o adsorpci mohou být použita pro účely porovnání a modelování (19, 33, 34, 35).

Rozdělení chemické látky mezi půdu a vodní fázi je složitý proces, který závisí na řadě různých faktorů: na chemické povaze látky (12, 36, 37, 38, 39, 40), na charakteristikách půdy (4, 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) a na klimatických faktorech, jako jsou srážky, teplota, sluneční svit a vítr. Početné fenomény a mechanismy účastnící se adsorpce chemické látky v půdě tedy nelze v celém rozsahu definovat zjednodušeným laboratorním modelem, na jakém je založena tato metoda. Přestože nelze tímto pokusem podchytit všechny možné případy z životního prostředí, poskytuje cenné informace o významnosti adsorpce chemické látky z hlediska životního prostředí. Viz také obecný úvod.

XVIII. 1.2 POUŽITÍ

Tato metoda je zaměřena na odhad adsorpčního/desorpčního chování látky v půdách. Cílem je získat sorpční charakteristiky, které lze použít pro předpověď rozdělení za nejrůznějších podmínek v životním prostředí; k tomuto účelu se pro chemickou látku stanovují rovnovážné adsorpční koeficienty v různých půdách jako funkce půdních charakteristik (např. obsahu organického uhlíku, obsahu jílu, půdní textury a pH). Pro co nejširšího podchycení interakcí dané látky s půdami vyskytujícími se v přírodě musí být použity při zkoušce různé druhy půd.

V této metodě vyjadřuje adsorpce proces vázání chemické látky na půdní povrch; nerozlišuje se mezi různými adsorpčními procesy (fyzikální a chemickou adsorpcí) a procesy, jako jsou povrchově katalyzovaný rozklad, adsorpce velkých množství nebo chemická reakce. Adsorpce na koloidních částicích (průměr < 0,2 µm) vznikajících v půdě se nebere v úvahu.

Půdními parametry, které jsou považovány za nejdůležitější, jsou: obsah organického uhlíku (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48), obsah jílu a půdní textura (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48) a pro disociující sloučeniny také pH (3, 4, 42). Dalšími půdními parametry, které mohou mít vliv na adsorpci/desorpci určité látky jsou efektivní kationtová výměnná kapacita (ECEC), obsah amorfních oxidů železa a hliníku, zejména u vulkanických a tropických půd (4) a rovněž měrný povrch (49).

Zkouška je navržena pro posouzení adsorpce chemické látky na různých druzích půd s různým obsahem organického uhlíku, jílu, různou půdní texturou a různým pH. Je troj stupňová:

Stupeň 1: Předběžná zkouška za účelem stanovení:

poměru půda/roztok,

rovnovážného adsorpčního času a množství zkoušené látky adsorbovaného v rovnováze,

adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušební nádoby a stálosti zkoušené látky v průběhu zkoušky.

Stupeň 2: Screeningová zkouška: studie adsorpční kinetiky a stanovení distribučních koeficientů Kd a Kou pro pět druhů půd a jednu koncentraci.

Stupeň 3: Stanovení Freundlichových isotherm za účelem zjištění vlivu koncentrace na velikost adsorpce na půdách.

Studie desorpce prostřednictvím desorpční kinetiky/ Freundlichových desorpčních isotherm (dodatek 1).

XVIII.1.3 DEFINICE A JEDNOTKY

SymbolDefiniceJednotky
Atiprocento adsorpce v čase ti%
Aeqprocento adsorpce v adsorpční rovnováze%
mpads (ti)množství zkoušené látky adsorbované na půdě v čase tiµg
mpads (∆ti)množství zkoušené látky adsorbované na půdě za časový interval ∆tiµg
mpads (eq)množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnovázeµg
m0množství zkoušené látky ve zkušební nádobě na začátku adsorpční zkouškyµg
mmads (ti)množství zkoušené látky naměřené v podílu (vaA) v okamžiku tiµg
mvads (eq)množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnovázeµg
mpůdamnožství půdní fáze vyjádřené v suché hmotnosti půdyg
Czáshmotnostní koncentrace zásobního roztoku látkyµg∙cm-3
C0počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdouµg∙cm-3
Cvodads(ti)hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna analýzaµg∙cm-3
Cpads(eq)množství látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnovázeµg∙cm-3
Cvodads(eq)hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v adsorpční rovnovázeµg∙cm-3
V0počáteční objem vodné fáze v kontaktu s půdou během adsorpční zkouškycm3
vaAobjem podílu, ve kterém je látka stanovovánacm3
Kddistribuční koeficient pro adsorpcicm3∙g-1
Kouadsorpční koeficient normalizovaný ria organický uhlíkcm3∙g-1
Komdistribuční koeficient normalizovaný na obsah organického materiálucm3∙g-1
KFadsFreundlichův adsorpční koeficientµg1-1/n(cm3)1/n∙g-1
1/nFreundlichův exponent
Dtiprocento desorpce v čase ti%
D∆tiprocento desorpce za časový interval ∆ti%
Kdeszdánlivý desorpční koeficientcm3∙g-1
KFdesFreundlichův desorpční koeficientµg1-1/n (cm3)1/n∙g-1
mvoddes(ti)množství zkoušené látky desorbované z půdy v čase tiµg
mvoddes(∆ti)množství zkoušené látky desorbované z půdy za časový interval ∆tiµg
mmdes(eq)analyticky stanovené množství látky ve vodné fázi v desorpční rovnovázeµg
mvoddes(eq)celkové množství zkoušené látky desorbované v desorpční rovnovázeµg
mpdes(∆ti)množství látky, která zůstává adsorbovaná na půdě po uplynutí časového intervalu ∆tiµg
mvodAmnožství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy,
a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze
µg
Cpdes(eq)množství zkoušené látky, které zůstalo adsorbované na půdě v desorpční rovnovázeµg∙g-1
Cvoddes(eq)hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v desorpční rovnovázeµg∙cm-3
VTcelkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou během experimentu pro studium desorpční
kinetiky provedeného sériovou metodou
cm3
VRobjem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy
a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2
cm3
vaDobjem podílu odebraného k analýze od okamžiku ti během experimentu pro studium
desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou
cm3
Vriobjem roztoku odebraného ze zkušební nádoby (i) ke stanovení zkoušené látky v experimentu
pro studium desorpční kinetiky (paralelní metoda)
cm3
VrFobjem roztoku odebraného ze zkušební nádoby ke stanovení zkoušené látky
v desorpční rovnováze
cm3
MBmnožstevní bilance%
mEcelkové množství zkoušené látky extrahované z půdy a ze stěn zkušební nádoby
ve dvou krocích
µg
Vrecobjem supernatantu získaný po dosažení adsorpční rovnováhycm3
Povrozdělovací koeficient oktanol/voda
pKadisociační konstanta
Svrozpustnost ve voděg∙l-1

XVIII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Známé objemy roztoků zkoušené látky o známé koncentraci, značené nebo neznačené radionuklidy, se v 0,01M CaCl2 přidají k půdním vzorkům o známé sušině, které byly předběžně uvedeny do rovnováhy s 0,01M CaCl2. Směs se přiměřenou dobu protřepává. Půdní suspenze se poté oddělí centrifugaci a podle požadavků zfiltruje a vodná fáze se analyzuje. Množství zkoušené látky adsorbované na půdním vzorku se. vypočte z rozdílu mezi počátečním množstvím zkoušené látky v roztoku a množstvím, které v něm zbylo na konci experimentu (nepřímá metoda).

Alternativně lze adsorbované množství zkoušené látky stanovit také přímo analýzou půdy (přímá metoda). Tato metoda, která zahrnuje postupnou extrakci vhodným rozpouštědlem se doporučuje v případech, kdy nelze přesně stanovit rozdíl koncentrací látky v roztocích. Jde například o tyto případy: adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušebních nádob, nestálost zkoušené látky v poměru k délce experimentu, nízká adsorpce s malou změnou koncentrace v roztoku a vysoká adsorpce, jejímž důsledkem je nízká koncentrace, kterou nelze přesně stanovit. Použije-li se látka značená radioizotopy, lze extrakci půdy obejít analýzou půdní fáze spočívající v jejím spálení a v měření kapalinovou scintilační spektrometrií. Měření kapalinovou scintilační spektrometrií je nespecifickou technikou, která nerozlišuje mezi mateřskými a transformačními produkty; měla by tedy být použita pouze tehdy, je-li zkoušené chemická látka po celou dobu studie stálá.

XVIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

Chemikálie musí být analytické čistoty. Doporučuje se použití radioizotopově neznačených zkoušených látek se známým složením a alespoň 95% čistotou, nebo zkoušených látek značených radioizotopy, které mají známé složení a jsou radioizotopově čisté. U stopovačů s krátkým poločasem rozpadu musí být provedena korekce na rozpad.

Před prováděním zkoušek adsorpce-desorpce by měly být o zkoušené látce známy tyto informace:

a) rozpustnost ve vodě (A.6);

b) tlak par (A.4) a/nebo Henryho konstanta;

c) abiotický rozklad: hydrolýza jako funkce pH (C.7);

d) rozdělovací koeficient (A.8);

e) snadná rozložitelnost (C.4) nebo aerobní a anaerobní transformace v půdě;

f) pKa disociovatelných látek;

g) přímá fotolýza ve vodě (tj. UV-Vis absorpční spektrum ve vodě, kvantový výtěžek) a fotodegradace v půdě.

XVIII.1.6 POUŽITELNOST ZKOUŠKY

Zkouška je použitelná u látek, pro něž existuje analytická metoda s dostatečnou správností. Důležitým parametrem, který může ovlivnit spolehlivost výsledku, zejména při nepřímé metodě, je stálost zkoušené látky po celou dobu zkoušky. Je tedy nezbytné ověřit stabilitu v předběžné studii; je-li v průběhu zkoušky pozorována transformace látky, doporučuje se, aby byla v hlavní studii provedena analýza jak půdní, tak vodné fáze.

Obtíže mohou nastat při provádění této zkoušky u látek s nízkou rozpustností ve vodě (Sv < 10-4 g∙l-1) a rovněž u silně nabitých látek v důsledku toho, že koncentraci ve vodné fázi nelze změřit s dostatečnou správností. V těchto případech musí být podniknuty další kroky. Doporučení pro řešení těchto problémů je uvedeno v příslušných částech této metody.

Při zkoušení těkavých látek je třeba dbát na to, aby nedošlo v průběhu studie ke ztrátám.

XVIII.1.7 POPIS METODY

XVIII.1.7.1 Přístroje, pomůcky a reakční činidla

Standardní laboratorní vybavení, zejména:

a) Zkumavky nebo nádoby pro provedení experimentů. Je důležité, aby tyto zkumavky nebo nádoby

patřily k centrifuze, aby se minimalizovaly nepřesnosti v důsledku manipulace a přenášení,

byly z inertního materiálu, který minimalizuje adsorpci zkoušené látky na jejich stěnách.

b) Mísicí zařízení: překlápěcí mísič nebo rovnocenné zařízení; mísič musí v průběhu mísení udržovat půdu v suspenzi.

c) Centrifuga: nejlépe vysokootáčková, např. s odstředivým zrychlením > 3 000 g, s nastavením teploty, schopná odstředit z vodného roztoku částice o průměru větším než 0,2 µm. Kyvety by měly být během třepání a centrifugace opatřeny víčky, aby nedošlo ke ztrátám těkavých látek a vody; aby se minimalizovala adsorpce na víčkách, použijí se víčka z neadsorbujících materiálů, např. víčka se závitem potažená teflonem.

d) Volitelné: filtrační zařízení; filtry o velikosti pórů 0,2 µm, sterilní, na jedno použití. Zvláštní pozornost by měla být věnována volbě filtračního materiálu, aby na něm nedošlo k žádným ztrátám zkoušené látky; u špatně rozpustných zkoušených látek se organický filtrační materiál nedoporučuje.

e) Analytické přístroje vhodné pro měření koncentrace zkoušené látky.

f) Laboratorní sušárna umožňující udržovat teplotu od 103 °C do 110 °C.

XVIII.1.7.2 Charakterizace a výběr půd

Půdy by měly být charakterizovány třemi parametry, které jsou považovány za nejdůležitější pro adsorpční kapacitu: obsahem organického uhlíku, obsahem jílu a půdní texturou a hodnotou pH. Jak již bylo uvedeno, (viz oddíl Použití), mohou mít vliv na další adsorpci/desorpci určité látky fyzikálně-chemické charakteristiky půdy a měly by být v takových případech zohledněny.

Metody použité pro charakterizaci půdy jsou velmi důležité a mohou významně ovlivnit výsledky. Doporučuje se tedy, aby bylo podle odpovídající metody ISO (ISO-10390-1) pH měřeno v 0,01M CaCl2 (jde o roztok použitý při zkoušení adsorpce/desorpce). Doporučuje se rovněž, aby byly ostatní důležité půdní charakteristiky stanoveny standardními metodami (např. ISO „Handbook of Soil Analysis“); to umožní, aby byla analýza sorpčních dat založena na mezinárodně standardizovaných půdních parametrech. Některé existující standardní metody analýzy a charakterizace půdy jsou uvedeny v literatuře (50 - 52). Ke kalibraci metod zkoušení půd se doporučují referenční půdy.

Návod pro výběr půd pro adsorpční/desorpční experimenty je uveden v tabulce 1. Sedm vybraných druhů půd pokrývá půdní druhy vyskytující se v mírném zeměpisném pásmu. V případě disociovatelných zkoušených látek by měly vybrané půdy pokrývat širokých rozsah pH, aby bylo možné hodnotit adsorpci látky v její disociované a nedisociované formě. Návod k volbě počtu různých půd, které mají být použity v jednotlivých stádiích zkoušky, je uveden v bodě 1.9. Provedení zkoušky.

Upřednostňují-li se jiné druhy půd, měly by být charakterizovány stejnými parametry a jejich charakteristiky by se měly pohybovat ve stejném rozpětí jako v tabulce 1, třebaže kritériím neodpovídají přesně.

Tabulka 1: Návod pro výběr půdních vzorků pro adsorpci/desorpci

Druh
půdy
Rozsah pH
(v 0,01M CaCl2)
Obsah
organického
uhlíku
(%)
Obsah jílu
(%)
Textura půdy1
14,5 - 5,51,0 - 2,065 - 80jíl
2> 7,53,5 - 5,020 - 40jílovitohlinitá
35,5 - 7,01,5 - 3,015 - 25prachovitohlinitá
44,0 - 5,53,0 - 4,015 - 30hlinitá
5< 4,0 - 6,0 2< 0,5 - 1,5 2,3< 10 - 15 2hlinitopísčitá
6> 7,0< 0,5 - 1,0 2,340 - 65jílovitohlinitá/jíl
7> 10< 10písek/hlinitopísčitá

1 Podle FAO a severoamerického systému (85).

2 Hodnoty jednotlivých parametrů by měly pokud možno ležet v uvedeném rozsahu. Vyskytnou-li se obtíže při hledání vhodného půdního materiálu, jsou přijatelné hodnoty ležící pod uvedeným minimem.

3 U půd s obsahem organického uhlíku nižším než 0,3 % může být porušena korelace mezi obsahem organického uhlíku a adsorpci. Doporučují se tedy půdy s minimálním obsahem organického uhlíku 0,3 %.

XVIII.1.7.3 Sběr a uchovávání půdních vzorků

XVIII.1.7.3.1 Sběr

Není doporučena žádná specifická technika odběru vzorků; technika odběru závisí na účelu studie (53, 54, 55, 56, 57, 58).

Je třeba zohlednit:

a) nezbytné jsou informace o historii lokality; zahrnují informace o lokalitě, vegetaci, použití pesticidů nebo hnojiv, o biologických vnosech nebo náhodné kontaminaci. Pokud jde o popis místa odběru, měla by být dodržena doporučení normy ISO o vzorkování. půd (ISO 10381-6);

b) místo odběru musí být definováno souřadnicemi UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) nebo zeměpisnými souřadnicemi; to by mohlo umožnit opakovaný odběr dané půdy v budoucnu nebo usnadnit definování půdy podle různých klasifikačních systémů používaných v různých zemích. Kromě toho by měla být vzorkován pouze horizont A do maximální hloubky 20 cm. Zvláště je-li u půdního druhu č. 7 součástí půdy horizont 0h, měl by být zahrnut do vzorkování.

Půdní vzorky by měly být přepravovány v kontejnerech a za teploty, jež zaručí, že nedojde k výrazné změně původních charakteristik půdy.

XVIII.1.7.3.2 Uchovávám

Přednost se dává se použití čerstvě odebraných půd. Pouze není-li to možné, mohou být půdy uchovávány při teplotě okolí, případně vysušené na vzduchu. Pro dobu uchovávání neexistuje žádný doporučený limit, ale půdy uchovávané déle než tři roky by měly být před použitím analyzovány na obsah organického uhlíku, pH a CEC (kationtovou výměnnou kapacitu).

XVIII.1.7.3.3 Zpracování půdních vzorků a jejich příprava ke zkoušce

Půdy se vysuší na vzduchu při teplotě okolí (nejlépe při 20 - 25 °C). Rozrušení půd se provede minimální silou, aby se původní textura půdy změnila co nejméně. Půdy se prosejí na sítu ≤ 2 mm; při prosévání by měla být dodržována doporučení normy ISO (ISO 10381-6). Doporučuje se opatrná homogenizace, neboť zlepšuje reprodukovatelnost výsledků. Vlhkost každé půdy se stanoví na třech dílčích vzorcích zahříváním na 105 °C, dokud se významně mění hmotnost (přibližně 12 h). Ve všech výpočtech je hmotností půdy hmotnost po sušení (sušina), tj. hmotnost půdy korigovaná na obsah vlhkosti.

XVIII.1.7.4 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu

Zkoušená látka se rozpustí v 0,01M roztoku CaCl2 v destilované nebo deionisované vodě; roztok CaCl2 se použije jako vodná rozpouštědlová fáze ke zlepšení centrifugace a minimalizaci kationtové výměny. Koncentrace zásobního roztoku by měla být nejlépe o tři řády vyšší než mez stanovitelnosti použité analytické metody. Tento práh zabezpečuje přesnost měření s ohledem na metodiku, jež je základem tohoto postupu; kromě toho by měla být koncentrace zásobního roztoku pod rozpustností zkoušené látky ve vodě.

Zásobní roztok se připravuje nejlépe těsně před aplikací na půdní vzorky a uchovává se uzavřený v temnu při 4 °C. Skladovatelnost závisí na stálosti zkoušené látky a na její koncentraci v roztoku.

Pouze u špatně rozpustných látek (Sv -4 g∙l-1) může být nezbytné použít solubilizační činidlo, je-li obtížné zkoušenou látku rozpustit. Solubilizační činidlo: a) by mělo být mísitelné s vodou, např. methanol nebo acetonitril, b) jeho koncentrace by neměla překročit 1 % celkového objemu zásobního roztoku a ještě méně by ho mělo být v roztoku přicházejícím do kontaktu s půdou (nejlépe v koncentraci nižší než 0,1 %), a c) nemělo by být surfaktantem nebo by nemělo podléhat solvolytickým reakcím se zkoušenou chemickou látkou. Použití solubilizačního činidla by mělo být uvedeno a odůvodněno v přehledu dat.

Jinou možností u špatně rozpustných látek je jejich přimíchání do systému (spiking): zkoušená látka se rozpustí v organickém rozpouštědle a alikvot se přidá do směsi půdy a 0,01M roztoku CaCl2 v destilované nebo deionisované vodě. Obsah organického rozpouštědla ve vodné fázi by měl být co nejnižší a obvykle by neměl překročit 0,1 %. Nedostatkem přimíchání v organickém rozpouštědle je nereprodukovatelnost objemu. To může znamenat zanesení další nepřesnosti, neboť koncentrace zkoušené látky a spolurozpouštědla nebývají ve všech zkouškách tytéž.

XVIII.1.8 PŘEDPOKLADY PRO PROVEDENÍ ZKOUŠKY ADSORPCE/DESORPCE

XVIII.1.8.1 Analytická metoda

Klíčovými parametry, které mohou mít vliv na správnost měření sorpce, jsou správnost metody analýzy jak roztoku, tak adsorbované fáze, stálost a čistota zkoušené látky, dosažení sorpční rovnováhy, velikost změny koncentrace v roztoku, poměr půda/roztok a změny v půdní struktuře během ustavování rovnováhy (35, 59 - 62). Některé příklady týkající se problematiky správnosti jsou uvedeny v dodatku 2.

Spolehlivost použité analytické metody musí být ověřována při koncentracích, které se mohou vyskytnout v průběhu zkoušky. Je na experimentátorovi, aby vyvinul vhodnou metodu s náležitou správností, přesností, reprodukovatelností, mezí stanovitelnosti a výtěžkem. Návodem k provedení takové zkoušky je níže uvedený experiment.

Vhodný objem 0,01 M CaCl2, např. 100 cm3, se protřepává 4 h s např. 20 g půdy o vysoké adsorpční schopnosti, tj. s vysokým obsahem organického uhlíku a jílu; tato hmotnost a objem se mohou měnit podle požadavků analýzy, avšak poměr půda/roztok 1:5 je vhodnou výchozí hodnotou. Směs se odstředí a vodnou fázi lze zfiltrovat. K vodné fázi se přidá určitý objem zásobního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo nominální hodnoty v koncentračním rozsahu, který se může vyskytnou v průběhu zkoušky. Tento objem by neměl překročit 10 % konečného objemu vodné fáze, aby byl charakter roztoku před ustavením rovnováhy změněn co nejméně. Roztok se analyzuje.

Založí se jeden slepý pokus s půdou a roztokem CaCl2 (bez zkoušené látky) s cílem odhalit náhodné chyby analytické metody a matricové jevy způsobené půdou.

Mezi analytické metody, které mohou být použity v sorpčních měřeních, patří plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází, (GLC), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), spektrometrie (např. GC/hmotnostní spektrometrie, HPLC/hmotnostní spektrometrie) a kapalinová scintilační spektrometrie (pro látky značené radioizotopy). Bez ohledu na použitou analytickou metodu se za přiměřené považují výtěžky od 90 % do 110 % nominální hodnoty. Má-li být možné provést stanovení a zhodnocení poté, co dojde k rozdělení, musí být meze stanovitelnosti analytické metody alespoň o dva řády nižší než nominální koncentrace.

Charakteristiky a meze stanovitelnosti analytické metody použitelné pro provedení studií adsorpce hrají významnou roli při definování zkušebních podmínek a při celém experimentálním provedení zkoušky. Tato metoda sleduje obecný experimentální postup a obsahuje doporučení a pokyny pro alternativní řešení, jsou-li analytická metoda a laboratorní vybavení omezeny.

XVIII.1.8.2 Výběr optimálních poměrů půda/roztok

Výběr vhodných poměrů půda/roztok pro sorpční studie závisí na distribučním koeficientu Kd a na požadovaném relativním stupni adsorpce. Změna koncentrace látky v roztoku je určující pro statistickou správnost měření v důsledku formy adsorpční rovnice a omezení analytické metodiky při stanovování koncentrace chemické látky v roztoku. V obecné praxi je tedy užitečné určit několik pevných poměrů, pro něž je adsorbovaný podíl vyšší než 20 %, nejlépe > 50 % (62), a dbát na to, aby byla koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi dostatečně vysoká pro její správné změření. To je zvláště důležité u vysokých adsorbovaných podílů.

Vyhovující přístup k výběru vhodných poměrů půda/voda je založen na odhadu hodnoty Kd buď předběžnými studiemi, nebo zavedenými metodami odhadu (dodatek 3). Vhodný poměr lze poté vybrat na základě grafického provedení závislosti poměru půda/roztok na Kd pro daný adsorbovaný podíl (obrázek 1). V tomto grafickém vyjádření se předpokládá, že je adsorpční rovnice lineární1. Použitelný poměr se získá upravením rovnice pro Kd (4) do tvaru rovnice (1):

V0m0
——— = ( ———— − 1) Kd (1)
mpůdampads (eq)

nebo do její logaritmické formy při předpokladu

mpads (eq)
R = mpůda/V0 a Aeq %/100 = ————
m0
( Aeq % / 100)
log R = − log Kd + log [———————] (2)
(1 − Aeq % / 100)

Obrázek

Distribuční koeficient Kd(cm3∙g-1)

Obrázek 1. Vztah mezi poměry půda/roztok a hodnotou Kd při různých adsorbovaných podílech zkoušeně látky

Na obrázku 1 jsou uvedeny požadované poměry půda/roztok jako funkce Kd pro různé úrovně adsorpce. Například při poměru půda/roztok 1:5 a při Kd rovno 20 by došlo přibližně k 80% adsorpci. Má-li dojít při téže hodnotě Kd k 50% adsorpci, musí být použit poměr 1:25. Tento přístup k výběru vhodných poměrů půda/roztok umožňuje výzkumníkovi pružně vyhovět experimentálním potřebám.

Obtíže nastávají v oblastech, kdy se chemická látka adsorbuje silně nebo velmi slabě. Je-li adsorpce nízká, doporučuje se poměr půda/roztok 1:1, třebaže u některých vysloveně organických druhů půdy může být k získání suspenze nezbytný nižší poměr. Analytická metodika měření malých změn koncentrace roztoku musí být pečlivá; v opačném případě bude měření nepřesné. Na druhé straně se může při velmi vysokých distribučních koeficientech Kd dospět až k poměru půda/roztok 1:100, má-li v roztoku zůstat významné množství chemické látky. Je však třeba dbát na dobré promíchání a musí být ponechána dostatečná doba k tomu, aby systém dosáhl rovnováhy. Jiným přístupem je v těchto extrémních případech, kdy chybí vhodná metodika, odhadnutí hodnoty Kd metodou založenou například na hodnotách Pov (dodatek 3). Může být užitečný zvláště u slabě adsorbovaných polárních chemických látek s Pov < 20 a u lipofilních/silně adsorbovaných chemických látek s Pov > 104.

XVIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY

XVIII.1.9.1 Zkušební podmínky

Všechny experimenty se provádějí při teplotě okolí a pokud možno při konstantní teplotě od 20 °C do 25 °C.

Parametry odstřeďování by měly umožnit odstranit z roztoku částice větší než 0,2 µm. Tuto velikost mají nejmenší částice považované za pevné částice a je hranicí mezi pevnými a koloidními částicemi. Návod ke stanovení parametrů odstřeďování je uveden v dodatku 4.

Nezaručuje-li centrifuga, že budou částice větší než 0,2 µm odstraněny, mohla by být použita kombinace odstřeďování a filtrace přes 0,2µm filtry. Tyto filtry musí být z vhodného inertního materiálu, aby na nich nedošlo k žádným ztrátám zkoušené látky. V každém případě by mělo být ověřeno, že při filtraci nedochází k žádným ztrátám zkoušené látky.

XVIII.1.9.2 Stupeň 1 - předběžná studie

Účel provedení předběžné studie byl již uveden v oddíle Použití. Návodem pro založení takové studie je níže navržený experiment.

XVIII.1.9.2.1 Výběr optimálních poměrů půda/roztok

Použijí se dva půdní druhy a tři poměry půda/roztok (šest. experimentů). Jeden půdní druh s vysokým obsahem organického uhlíku a nízkým obsahem jílu a druhý půdní druh s nízkým obsahem organického uhlíku a vysokým obsahem jílu. Jsou navrženy následující poměry půda/roztok:

50 g půdy a 50 cm3 vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/1),

10 g půdy a 50 cm3 vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/5),

2 g půdy a 50 cm3 vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/25).

Minimální množství půdy, se kterým lze experiment provést, závisí na laboratorním vybavení a na účinnostních charakteristikách použitých analytických metod. Doporučuje se však použít alespoň 1 g, a nejlépe 2 g, aby zkouška poskytla spolehlivé výsledky.

Jeden kontrolní vzorek obsahující pouze zkoušenou látku v 0,01M CaCl2 (bez půdy) se podrobí naprosto stejným krokům jako zkušební systémy, s cílem ověřit stálost zkoušené látky v roztoku CaCl2 a její možnou adsorpci na stěnách zkušební nádoby.

Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí slepý vzorek s každou půdou a celkem 50 cm3 0,01M roztoku CaCl2 (bez zkoušené látky). Účelem je kontrola pozaďových hodnot během analýzy s cílem detekovat interferující látky nebo rozeznat kontaminované půdy.

Všechny experimenty včetně kontrolních a slepých vzorků se provedou alespoň dvojmo. Celkový počet vzorků, které by měly být pro studii připraveny, lze odvodit z metodiky, podle které bude postupováno.

Metody pro předběžnou studii a hlavní studii jsou zpravidla stejné, výjimky jsou podle potřeby uvedeny.

Vzorky vysušené na vzduchu se den před experimentem uvedou přes noc (12 h) do rovnováhy protřepáváním s 45 cm3 0,01M CaCl2. Poté se určitým objemem zásobního roztoku zkoušené látky upraví konečný objem na 50 cm3. Tento objem přidaného zásobního roztoku: a) by neměl být vyšší než 10 % konečného objemu 50 cm3 vodné fáze, aby byl charakter roztoku před ustavením rovnováhy změněn co nejméně; a b) měl by zajistit, že bude počáteční koncentrace zkoušené látky v kontaktu s půdou (C0) alespoň o dva řády vyšší než mez stanovitelnosti analytické metody; tento práh zabezpečuje možnost provést přesné měření i při vysoké adsorpci (> 90 %) a později stanovit adsorpční izotermy. Doporučuje se rovněž, aby počáteční koncentrace látky (C0) pokud možno nepřekračovala polovinu hodnoty rozpustnosti látky.

Příklad výpočtu koncentrace zásobního roztoku látky (Czás) je uveden níže. Předpokládá se mez stanovitelnosti 0,01 µg·cm-3 a 90% adsorpce; počáteční koncentrace zkoušené látky v kontaktu s půdou by tedy měla být nejlépe 1 µg·cm-3 (o dva řády vyšší, než je mez stanovitelnosti). Za předpokladu, že bude přidán maximální doporučený objem zásobního roztoku, tj. 5 cm3 do 45 cm3 0,01M roztoku CaCl2 pro ustavení rovnováhy, (= 10% přídavek zásobního roztoku v celkovém objemu vodné fáze 50 cm3), by měla být koncentrace zásobního roztoku 10 µg·cm-3; je o tři řády vyšší než mez stanovitelnosti analytické metody.

Hodnota pH vodné fáze se měří před kontaktem s půdou a po něm, neboť hraje významnou roli v celém adsorpčním procesu, zvláště u disociujících látek.

Směs se protřepává, dokud se neustaví adsorpční rovnováha. Doba nezbytná k dosažení rovnováhy v půdě silně kolísá v závislosti na chemické látce a půdě; zpravidla stačí 24 h (77). V předběžné studii lze vzorky odebírat postupně v průběhu míchání po 48 h (například 4, 8, 24, 48 h). Čas analýzy by měl být volen pružně s ohledem na pracovní plán laboratoře.

Existují dvě možnosti, jak provádět analýzu zkoušené látky ve vodném roztoku: a) paralelní metoda a b) sériová metoda. Je třeba zdůraznit, že ačkoli je paralelní metoda experimentálně náročnější, je její matematické zpracování jednodušší (dodatek 5). Volba metodiky, podle které bude postupováno, se však ponechává na experimentátorovi, který bude muset zvážit dostupné laboratorní vybavení a prostředky.

a) Paralelní metoda: pro každý poměr půda/roztok se připraví tolik vzorků, kolik bude časů, v nichž se má provést vyšetření adsorpční kinetiky. Po centrifugaci a podle požadavku po filtraci se z první zkušební nádoby odebere pokud možno celá vodná fáze a měří se např. po 4 h; vodná fáze druhé zkušební nádoby se takto zpracuje a změří po 8 h, vodná fáze třetí zkušební nádoby se takto zpracuje a změří po 24 h atd.

b) Sériová metoda: pro každý poměr půda/roztok se připraví pouze dva vzorky. V definovaných časových intervalech se směs zcentrifuguje a fáze se oddělí. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkoušenou látku; v experimentu se poté pokračuje s původní směsí. Následuje-li po centrifugaci filtrace, měla by mít laboratoř zařízení pro filtraci malých podílů vodné fáze. Doporučuje se, aby celkový objem odebraného podílu nepřesahoval 1 % celkového objemu roztoku, aby se významně nezměnil poměr půda/roztok a aby se nesnížilo množství rozpuštěné látky dostupné během zkoušky pro adsorpci.

Procento adsorpce Ati se pro každý čas (ti) vypočte z nominální počáteční koncentrace a naměřené koncentrace v odběrovém čase (ti) po korekci na hodnoty ze slepého pokusu. Sestrojí se křivky závislosti Ati na čase (obrázek 1 v dodatku 5) za účelem odhadu míry dosažení rovnovážného plató2. Rovněž se vypočte hodnota Kd v rovnováze. Na základě této hodnoty se z obrázku 1 vyberou vhodné poměry půda/roztok tak, aby adsorpce dosahovala více než 20 % a nejlépe více než 50 % (61). Všechny příslušné rovnice a zásady pro sestrojování křivek jsou uvedeny v oddíle Data a zprávy a v dodatku 5.

XVIII.1.9.2.2 Stanovení rovnovážného adsorpčního času a množství zkoušené látky adsorbovaného v rovnováze

Jak již bylo uvedeno, umožňuje křivka závislosti Ati nebo Cvodads na čase odhadnout dobu nezbytnou pro dosažení adsorpční rovnováhy a adsorbované množství zkušební látky v rovnováze. Příklady těchto křivek jsou na obrázcích 1 a 2 v dodatku 5. Rovnovážný čas je čas nezbytný k tomu, aby bylo v systému dosaženo plató.

Nevyskytuje-li se u určité půdy plató, ale nepřetržitý nárůst, může to být způsobeno komplikujícími faktory, jako jsou biologický rozklad a pomalá difuse. Biologický rozklad lze prokázat opakováním experimentu se sterilizovaným vzorkem půdy. Není-li ani v tomto případě dosaženo plató, měl by experimentátor pátrat po jiném jevu, ke kterému by mohlo při jeho studiích docházet; může tak učinit vhodnou změnou experimentálních podmínek (teploty, doby protřepávání, poměrů půda/roztok). Ponechává se na rozhodnutí experimentátora, zda bude pokračovat ve zkušebním postupu i přes případné nedosažení rovnováhy.

XVIII.1.9.2.3 Adsorpce na stěnách zkušební nádoby a stálost zkoušené látky

Některé informace o adsorpci zkoušené látky na stěnách zkušební nádoby a rovněž o stálosti zkoušené látky lze odvodit z analýzy kontrolních vzorků. Pozoruje-li se úbytek větší, než by odpovídalo obvyklé chybě analytické metody, může docházet k abiotickému rozkladu a/nebo adsorpci na stěnách zkušební nádoby. Tyto dva jevy lze rozlišit důkladným omytím stěn nádoby známým objemem vhodného rozpouštědla a analýzou výplachu na zkoušenou látku. Není-li zjištěna adsorpce na stěnách zkušební nádoby, je úbytek důkazem abiotické nestálosti zkoušené látky. Je-li zjištěna adsorpce, je nezbytné změnit materiál zkušebních nádob. Data o adsorpci na stěnách zkušebních nádob získaná v tomto experimentu však nelze přímo extrapolovat na experiment půda/roztok. Přítomnost půdy bude mít na tuto adsorpci vliv.

Další informace o stálosti zkoušené látky lze odvodit z množstevní bilance výchozí látky provedené po určitém čase. To znamená, že se na zkušenou látku analyzují vodná fáze, extrakty půdy a stěny zkušební nádoby. Rozdíl mezi množstvím přidané zkoušené látky a součtem množství zkoušené látky ve vodné fázi, v extraktech půdy a na stěnách zkušební nádoby je roven množství, které se rozložilo, vytěkalo a/nebo se neextrahovalo. Máli být provedena množstevní bilance, mělo by být v době experimentu dosaženo adsorpční rovnováhy.

Množstevní bilance se provede u obou druhů půd a pro jeden poměr půda/roztok u každé půdy, u něhož je úbytek v rovnováze větší než 20 % a nejlépe větší něž 50 %. Je-li experiment pro nalezení poměru dokončen analýzou posledního vzorku po 48 hodinách, fáze se oddělí centrifugací a podle požadavků filtrací. Odebere se pokud možno veškerá vodná fáze a k půdě se přidá vhodné extrakční rozpouštědlo (extrakční koeficient alespoň 95 %) za účelem extrakce zkoušené látky. Doporučují se alespoň dvě extrakce za sebou. Stanoví se množství zkoušené látky v půdě a v extraktech ze zkušební nádoby a provede se množstevní bilance (rovnice 10, Data a zprávy). Je-li nižší než 90 %, považuje se zkoušená látka za nestálou v poměru k délce zkoušky. Studie však může pokračovat, přičemž se zohlední nestálost zkoušené látky; v takovém případě se doporučuje, aby byly v hlavní studii analyzovány obě fáze.

XVIII.1.9.3 Stupeň 2 - adsorpční kinetika při jedné koncentraci zkoušené látky

Použije se pět druhů půd vybraných z tabulky 1. Je výhodné zahrnout mezi těchto pět půd některé nebo všechny půdy z předběžné studie. V tomto případě nemusí být stupeň 2 opakován pro půdy použité v předběžné studii.

Rovnovážný čas, poměr půda/roztok, hmotnost půdního vzorku, objem vodné fáze v kontaktu s půdou a koncentrace zkoušené látky v roztoku se volí na základě výsledků předběžné studie. Analýzy se provádějí nejlépe po 2, 4, 6, 8 (podle možnosti také po 1.0) a 24 h kontaktu s půdou; protřepávání může být prodlouženo až na maximálně 48 h u chemických látek, u nichž je pro dosažení rovnováhy podle výsledků předběžných studií nezbytný delší čas. Časy, kdy má být provedena analýza, lze volit pružně.

Každý experiment (s jednou půdou a s jedním roztokem) se provede alespoň dvojmo, aby bylo možné odhadnout rozptyl výsledků. S každým experimentem se provede slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01M roztokem CaCl2 bez zkoušené látky a se stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkoušené látky v 0,01 M roztoku CaCl2 (bez půdy), který slouží jako pojistka proti nečekaným výsledkům.

Procento absorpce se vypočte pro každý čas (Ati) a pro každý interval (A∆ti) (podle potřeby) a vynese se proti času. Rovněž se vypočtou distribuční koeficient Kd v rovnováze a adsorpční koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku Kou (pro nepolární organické chemické látky).

Výsledky zkoušky adsorpční kinetiky

Pro popis sorpčního chování v půdě je zpravidla dostatečně přesný lineární model Kd (35, 78), který je výrazem vlastní mobility chemických látek v půdě. Například chemické látky s Kd ≤ 1 cm3 g-1 jsou v zásadě považovány za zcela mobilní. Podobně byla MacCallem et al (16) vyvinuto klasifikační schéma mobility založené na hodnotách Kou. Kromě toho existuje klasifikační schéma vymývatelnosti založené na vztahu mezi Kou a DT-501 (1, 32,79).

Podle studií statistických chyb (61) nelze z poklesu koncentrace ve vodné fázi přesně odhadnout hodnoty Kd nižší než 0,3 cm3 g-1, a to ani při nejpříznivějším (z hlediska správnosti) poměru půda/roztok, tj. při poměru 1:1. V takovém případě se doporučuje analýza obou fází - půdy i roztoku.

S ohledem na výše uvedené poznámky se doporučuje pokračovat ve studii adsorpčního chování chemické látky v půdě a její případné mobility stanovením Freundlichových adsorpčních isotherm pro ty systémy, u nichž je přesné stanovení Kd možné postupem, popsaným v této zkušební metodě. Přesné stanovení je možné, je-li součin hodnoty Kd a poměru půda/roztok > 0,3 při měření založeném na poklesu koncentrace ve vodné fázi (nepřímá metoda), nebo je-li >0,1 při analýze obou fází (přímá metoda) (61).

XVIII.1.9.4 Stupeň 3 - adsorpční isothermy a desorpční kinetika/desorpční isothermy

XVIII.1.9.4.1 Adsorpční isothermy

Použije se pět koncentrací zkoušené látky, nejlépe v rozsahu dvou řádů; při volbě koncentrací se zohlední rozpustnost ve vodě a výsledná rovnovážná koncentrace ve vodné fázi. V průběhu zkoušky se u každé půdy použije tentýž poměr půda/roztok. Adsorpční zkouška se provede výše uvedenou metodou pouze s tím rozdílem, že se vodná fáze analyzuje pouze jednou po uplynutí doby, která je nezbytná pro dosažení rovnováhy a která byla stanovena dříve ve stupni 2. Stanoví se rovnovážné koncentrace v roztoku a adsorbované množství se vypočte z úbytku zkoušené látky v roztoku nebo přímou metodou. Adsorbované množství na jednotku množství půdy se vynese jako funkce rovnovážné koncentrace zkoušené látky (viz oddíl Data a zprávy).

Výsledky z experimentu pro stanovení adsorpčních isotherm

Z dosud navržených matematických modelů adsorpčních isotherm se k popisu adsorpčních procesů používá Freundlichova isotherma nejčastěji. Podrobnější informace o interpretaci a významu adsorpčních modelů jsou uvedeny v literatuře (41, 45, 80, 81, 82).

Poznámka: Je třeba poznamenat, že hodnoty KF (Freundlichových adsorpčních koeficientů) pro různé látky lze porovnávat pouze tehdy, jsou-li hodnoty KF vyjádřeny ve stejných jednotkách (83).

XVIII.1.9.4.2 Desorpční kinetika

Účelem tohoto experimentu je vyšetřit, zda je chemická látka adsorbována na půdě vratně nebo nevratně. Tato informace je důležitá, neboť desorpční proces hraje také důležitou roli v chování chemické látky v půdě. Desorpční data jsou kromě toho užitečným vstupem pro počítačové modelování vyluhování a pro simulaci vyplavování rozpuštěných látek. Je-li studie desorpce požadována, doporučuje se, aby byla níže popsaná studie provedena na každém systému, na kterém bylo v předchozím experimentu pro studii adsorpční kinetiky možné provést přesné stanovení Kd.

Podobně jako u studie adsorpční kinetiky existují dvě možnosti, jak postupovat při experimentu pro studium desorpční kinetiky: a) paralelní metoda a b) sériová metoda. Volba metodiky, podle které bude postupováno, se ponechává na experimentátorovy který bude muset zvážit dostupné laboratorní vybavení a prostředky.

a) Paralelní metoda: pro každou půdu zvolenou pro pokročení do studie desorpce se připraví tolik vzorků se stejným poměrem půda/roztok, kolik bude časů, v nichž se má studovat desorpční kinetika. Zvolí se nejlépe stejné časové intervaly, jako u experimentu pro studium adsorpční kinetiky; celkový čas se však prodlouží podle potřeby, aby v systému bylo dosaženo rovnováhy. S každým experimentem (s jednou půdou a s jedním roztokem) se provede slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01M roztokem CaCl2 bez zkoušené látky se stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkoušené látky v 0,01 M roztoku CaCl2 (bez půdy). Všechny směsi půdy s roztokem se protřepávají do ustavení adsorpční rovnováhy (která se zjišťuje postupem uvedeným dříve ve stupni 2). Poté se fáze oddělí centrifugací a vodná fáze se pokud možno kvantitativně odebere. Objem odebraného roztoku se nahradí stejným objemem 0,01M CaCl2 bez zkoušené látky a nová směs se opět protřepává. Kupříkladu po 2 h se pokud možno kvantitativně odebere a změří vodná fáze první zkušební nádoby, totéž se provede s vodnou fází druhé zkušební nádoby po 4 h, s vodnou fází třetí zkušební nádoby po 6 h atd., až do dosažení desorpční rovnováhy.

b) Sériová metoda: po experimentu pro stanovení adsorpční kinetiky se směs zcentrifuguje a vodná fáze se pokud možno kvantitativně odebere. Objem odebraného roztoku se nahradí stejným objemem 0,01M CaCl2 bez zkoušené látky. Nová směs se protřepává až do ustavení desorpční rovnováhy. Během této doby se ve stanovených časových intervalech směs centrifuguje za účelem oddělení fází. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkoušenou látku; v experimentu se poté pokračuje s původní směsí. Objem každého jednotlivého podílu by měl být menší než 1 % celkového objemu. Ke směsi se přidá stejný objem čerstvého 0,01M roztoku CaCl2, aby se zachoval poměr půda/roztok, a v protřepávání se pokračuje po další časový interval.

Procento desorpce se vypočte pro každý čas (Dti) a pro každý interval (D∆ti) (podle potřeb studie) a vynese se proti času. Rovněž se vypočte hodnota desorpčního koeficientu Kdes v rovnováze. Všechny příslušné rovnice jsou uvedeny v oddíle Data a zprávy a v dodatku 5.

Výsledky z experimentu pro studium desorpční kinetiky

Společný graf křivek závislostí procenta desorpce Dti a adsorpce Ati na čase umožní posoudit vratnost adsorpčního procesu. Je-li desorpční rovnováhy dosaženo do dvojnásobku času potřebného pro adsorpční rovnováhu a je-li celková desorpce vyšší než 75 % adsorbovaného množství, považuje se adsorpce za vratnou.

XVIII.1.9.4.3 Desorpční isothermy

Freundlichovy desorpční isothermy se vyšetřují na půdách použitých ke stanovení adsorpčních isotherm. Zkouška desorpce se provede způsobem popsaným v oddíle Desorpční kinetika, pouze s tím rozdílem, že se vodná fáze analyzuje pouze jednou, a to v desorpční rovnováze. Vypočte se desorbované množství zkoušené látky. Množství zkoušené látky, které zůstalo adsorbované na půdě po dosažení desorpční rovnováhy se vynese jako funkce rovnovážné koncentrace zkoušené látky v roztoku (viz oddíl Data a zprávy a dodatek 5).

XVIII.2 DATA A ZPRÁVY

Data z analýzy se předloží ve formě tabulky (viz dodatek 6). Uvedou se jednotlivá měření a vypočtené průměrné hodnoty. Předloží se grafy adsorpčních isotherm. Výpočty se provedou níže uvedeným způsobem.

Pro účely zkoušky se předpokládá, že hmotnost 1 cm3 vodného roztoku je 1 g. Poměr půda/roztok může být vyjádřen stejným číslem pro rozměr hmot./hmot. i pro rozměr hmot./obj.

XVIII.2.1 ADSORPCE

Adsorpce (Ati) je definována jako procentuální podíl látky z celkového množství látky na začátku zkoušky, který se za zkušebních podmínek naadsorboval na půdě. Je-li zkoušená látka stálá a neadsorbuje se významně na stěnách nádoby, vypočte se Ati pro každý čas z rovnice:

mpads (ti) · 100
Ati = —————— (%) (3)
m0

kde:

Ati = procento adsorpce v čase ti (%);

mpads(ti) = množství zkoušené látky adsorbované na půdě v čase ti (µg);

m0 = množství zkoušené látky ve zkumavce na začátku zkoušky (µg);

Podrobné informace o způsobu výpočtu procenta adsorpce Ati pro paralelní a sériovou metodu jsou uvedeny v dodatku 5.

Distribuční koeficient Kd je poměr mezi množstvím látky v půdě a hmotnostní koncentrací látky ve vodném roztoku za zkušebních podmínek a při dosažení adsorpční rovnováhy.

Cpads(eq)mpads(eq)V0
Kd = ————— = ————— · ——— (cm3 · g-1) (4)
Cvodads(eq) mvodads(eq) mpůda

kde:

Cpads(eq) = množství látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze (µg·g-1)

Cvodads(eq) = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v adsorpční rovnováze (µg·cm-3). Tato koncentrace se stanoví analyticky a zohlední se hodnoty ze slepých pokusů

mpads(eq) = množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze (µg)

mvads(eq) = božství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze (µg)

mpůda = množství půdní fáze vyjádřené v suché hmotnosti půdy(g)

v0 = počáteční objem vodné fáze v kontaktu s půdou (cm3).

Vztah mezi Aeq a Kd je dán rovnicí: